李慧，王柯

(1河南省人民醫(yī)院河南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州450003；2鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；3鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院)

皮膚惡性黑色素瘤極具侵襲性且易轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。手術(shù)切除是其惟一治愈方式，其他治療手段的失敗提示學(xué)者們對黑色素瘤發(fā)病的分子機制仍知之甚少，因此有必要更全面地了解黑色素瘤的轉(zhuǎn)錄圖譜和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。miRNA是內(nèi)源性非編碼小RNA總稱，可調(diào)控基因表達、參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[1]。因此，miRNA有望作為多種疾病診斷或治療的靶點。GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[2]由美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)于2000年創(chuàng)建，覆蓋疾病、代謝、藥理學(xué)等方面生物學(xué)內(nèi)容。2019年3月，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選所需數(shù)據(jù)，篩選原發(fā)性皮膚惡性黑色素瘤相關(guān)miRNA及其靶基因，并進行生物信息學(xué)分析，旨在為原發(fā)性皮膚惡性黑色素瘤的深入研究提供一定線索和幫助。

1 材料與方法

1.1 基因芯片來源 本研究中涉及的基因芯片平臺為GPL15019(Agilent-031181 Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_Microarray 030840)和GPL15183(CRUK/Melton lab-Human melanoma-71-v2-miRNA expression profiling)。詳見網(wǎng)址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GPL15019和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GPL15183。

1.2 差異表達miRNA篩選 經(jīng)檢索，符合本研究對象的數(shù)據(jù)集包括GSE34460和GSE35579;進入GEO2R(GEO數(shù)據(jù)庫自帶數(shù)據(jù)分析工具)頁面(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GSE34460)，并選擇項目“Analyze with GEO2R”，點擊“Define groups”對皮膚惡性黑色素瘤組織和皮膚良性黑素細胞痣組織進行分組，選擇“Save all results”并保存至TXT文檔。將該TXT文檔以Excel方式打開后，篩選同時滿足adj.P<0.01和|logFC|>1者[3]，其中l(wèi)ogFC>1者為在惡性黑色素瘤組織中相對良性黑素細胞痣組織中表達上調(diào)的miRNA，而logFC<-1者為在惡性黑色素瘤組織中相對良性黑素細胞痣組織中表達下調(diào)的miRNA。同樣方法篩選出GSE35579中差異表達miRNA，并與GSE34460中差異表達miRNA分別取交集，得到二者共同差異表達的miRNA[3]，以行進一步分析。

1.3 差異表達miRNA靶基因預(yù)測 借助miRecords(http://c1.accurascience.com/miRecords/)平臺[4]預(yù)測差異表達miRNA的靶基因。為降低軟件預(yù)測假陽性，擬定至少同時在5個預(yù)測軟件中均有記錄的基因才可作為靶基因[1]。

1.4 差異表達miRNA靶基因功能注釋及通路分析 以用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫DAVID6.8工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)為分析平臺，利用“Annotation summary results”中的“Gene Ontology”和“Pathways”功能，對皮膚惡性黑素瘤中差異表達miRNA的靶基因分別進行基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)分析，其中P<0.05提示結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義[3]。

1.5 miRNA靶基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 將皮膚惡性黑素瘤的差異表達miRNA的靶基因?qū)隨TRING在線分析軟件(http://string.embl.de/)，獲得靶基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，將獨立節(jié)點刪除后，繪制差異表達靶基因編碼蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。再將上述STRING數(shù)據(jù)庫中PPI網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape3.4.0軟件[5]，并通過“Molecular Complex Detection(MCODE)”工具對PPI網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析。根據(jù)相關(guān)文獻設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)[6]，分析完畢后，狀態(tài)為“seeds”的對應(yīng)基因即為核心基因，MCODE得分≥3且結(jié)點數(shù)≥4的聚類為關(guān)鍵聚類。

1.6 以核心基因為靶點的化合物篩選 在比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫中篩選能影響核心基因的化合物[7]，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址為http://ctd.mdibl.org/。

2 結(jié)果

2.1 皮膚惡性黑素瘤差異表達miRNA GSE34460芯片中共13個差異表達miRNA，GSE35579芯片中共70個差異表達miRNA；兩組芯片中共同差異表達miRNA共5個，且均表達下調(diào)，分別為hsa-miR-183、hsa-miR-200a、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-429(P分別為4.04E-06、1.21E-05、6.02E-05、6.05E-03、4.38E-02)。

2.2 差異表達miRNA靶基因預(yù)測 hsa-miR-183的靶基因包括IRS1、SCYL3、DCX、SMPD3、SOCS6、SLITRK1、CNTNAP2、FOXO1、MAP3K4等。hsa-miR-200a的靶基因包括ZEB2、CHP、RARB、NAP5、TMEM110、WDFY3、ZNF644、EXOC5等。hsa-miR-455-5p的靶基因包括CACNB4、TAF4、USP9X、HTR2C、TMEM30A、BRD1、NR4A2、DYNC1LI2及C4orf17等。hsa-miR-204的靶基因包括PLAG1、RPS6KC1、EFNB3、ESRRG、MON2、RSPO3、FAM134C、YARS及CHN2等。hsa-miR-429的靶基因包括LRP1B、FAM8A1、KIAA0355、OLIG3、REEP1、SNAP25、AFF3、GPM6A及AP1S2等。

2.3 差異表達miRNA靶基因功能注釋及通路分析 hsa-miR-183靶基因主要存在于胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)去磷酸化、多巴胺能神經(jīng)突觸相關(guān)信號通路等。hsa-miR-200a靶基因主要存在于胞質(zhì)，具有正性調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ啟動子、結(jié)合Ephrin受體等作用。hsa-miR-204靶基因主要存在于胞質(zhì)囊泡膜，參與調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ啟動子、雌激素信號通路等。hsa-miR-429靶基因主要位于胞質(zhì)，可負性調(diào)控細胞遷移、參與卵母細胞減數(shù)分裂等。hsa-miR-455-5p靶基因主要位于胞質(zhì)，參與心肌細胞中腎上腺素能信號傳導(dǎo)、Hippo信號通路等。詳見表1～5。

表1 hsa-miR-183靶基因基因功能及通路富集分析結(jié)果

表2 hsa-miR-200a靶基因基因功能及通路富集分析結(jié)果

表3 hsa-miR-204靶基因基因功能及通路富集分析結(jié)果

表4 hsa-miR-429靶基因基因功能及通路富集分析結(jié)果

表5 hsa-miR-455-5p靶基因基因功能及通路富集分析結(jié)果

2.4 差異表達miRNA靶基因編碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 hsa-miR-183靶基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由144個節(jié)點構(gòu)成，連接度為84；核心基因分別為PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B，關(guān)鍵聚類為PPP2CA、PPP2CB、PPP2R5C、PPP2R2A。hsa-miR-200a靶基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由127個節(jié)點構(gòu)成，連接度為95；核心基因為TMEM110，但無符合條件的聚類。hsa-miR-455-5p靶基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由105個節(jié)點構(gòu)成，連接度為40；MCODE分析顯示僅有2個結(jié)點，無法分析核心基因。hsa-miR-204靶基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由245個節(jié)點構(gòu)成，連接度為274；MCODE分析顯示僅有4個結(jié)點，無法分析核心基因。hsa-miR-429靶基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由20個節(jié)點構(gòu)成，連接度為1；核心基因為CLASP2，但無符合條件的聚類。經(jīng)Cytoscape平臺分析得到，皮膚惡性黑色素瘤差異表達miRNA靶基因編碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因為PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B、TMEM110和CLASP2。

2.5 以核心基因為靶點的毒物篩選 砷劑和二嗪農(nóng)均可影響PPP2CB基因甲基化，其中二嗪農(nóng)主要表現(xiàn)為促進作用。氯化鎘可抑制PPP2CB、TMEM110啟動子甲基化。黃曲霉毒素B1可抑制GATAD2B、CLASP2甲基化。三氯乙烯可以促進CLASP2甲基化。因此，以核心基因為靶點的毒物主要通過影響基因甲基化發(fā)揮作用。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微陣列芯片技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要地位?；蛐酒膹V泛應(yīng)用產(chǎn)生了海量的數(shù)據(jù)。通過挖掘數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，再用整合或?qū)φ昭芯康确椒ㄍ诰蚧蚧蚍蔷幋aRNA之間的關(guān)聯(lián)信息，繼而揭示基因或非編碼RNA之間復(fù)雜的作用機理是一種非常值得嘗試的研究策略。目前常用的基因信息數(shù)據(jù)庫包括TCGA和GEO。本研究所使用的篩選差異miRNA的工具為GEO數(shù)據(jù)庫自帶的GEO2R在線分析工具。此外本研究也使用了DAVID、STIRNG和Cytoscape等工具。

目前關(guān)于原發(fā)性皮膚惡性黑色素瘤的研究非常多，但人們對該疾病的認識仍不夠全面。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選所需數(shù)據(jù)并借助GEO2R等多種分析工具進行了一系列生物信息學(xué)分析，最終得到原發(fā)性皮膚惡性黑素瘤組織中差異表達的miRNA靶基因中的核心基因和關(guān)鍵聚類。本研究結(jié)果顯示，GSE34460和GSE3557兩組芯片中共同差異表達miRNA共5個，分別為hsa-miR-183、hsa-miR-200a、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-204和hsa-miR-429，均表達下調(diào)。差異表達miRNA的靶基因主要參與蛋白質(zhì)去磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子調(diào)節(jié)、結(jié)合Ephrin受體、細胞遷移調(diào)控、卵母細胞減數(shù)分裂、心肌細胞中腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，涉及通路包括多巴胺能神經(jīng)突觸相關(guān)信號通路、雌激素信號通路、Hippo信號通路等。經(jīng)Cytoscape平臺分析得到皮膚惡性黑色素瘤差異表達miRNA靶基因編碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因為PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B、TMEM110和CLASP2。上述核心基因相關(guān)的毒物包括砷劑、二嗪農(nóng)、氯化鎘、黃曲霉毒素B1、三氯乙烯，主要以影響基因甲基化發(fā)揮毒性作用。

2A型蛋白磷酸酶(PP2A)是體內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，主要參與減數(shù)分裂、有絲分裂、精子獲能、細胞凋亡等過程，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]，并且可能具有腫瘤抑制因子的功能。α異構(gòu)體(PPP2CA)和β異構(gòu)體(PPP2CB)是PP2A的催化亞基[9]，PPP2CA在惡性黑色素瘤中具有抗凋亡活性[10]。PPP2R5C和PPP2R2A是PP2A的調(diào)節(jié)亞基，PPP2R5C主要通過對P53蛋白某些位點氨基酸去磷酸化而實現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的作用[11]。與良性色素痣相比，PPP2R5C在惡性黑色素瘤中表達下調(diào)[8]。而PPP2CB及PPP2R2A與惡性黑色素瘤的關(guān)系尚未見文獻報道。

已有研究報道PLCB4在皮膚惡性黑色素瘤中突變率為21%～28%[12]，可能具有抑癌基因活性。深度測序分析還發(fā)現(xiàn)PLCB4基因突變在眼色素層惡性黑色素瘤[12]以及腦膜惡性黑色素瘤[13]的形成中具有重要作用，但具體機制尚未明確。RNF138是E3泛素化連接酶，被其鋅指結(jié)構(gòu)介導(dǎo)募集至DNA損傷位點并泛素化關(guān)鍵修復(fù)因子，促進同源重組修復(fù)[14]。由RNF138介導(dǎo)的RAD51D泛素化可促進DNA交聯(lián)損傷修復(fù)[15]、同源重組修復(fù)[16]和染色體完整性[15]，UBE2D-RNF138-CtIP軸也可促進DNA損傷修復(fù)[17]。但RNF138與惡性黑色素瘤的關(guān)系尚未見文獻報道。

GATAD2B是甲基化-CpG結(jié)合蛋白-1復(fù)合體(MECP1)的亞基，它可以去乙酰化甲基化核小體和抑制轉(zhuǎn)錄活性。GATAD2B可能與硬腦膜形成[18]和妊娠、分娩[19]有關(guān)。TMEM110是一種跨膜蛋白，它可通過STIM-ORAI信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-胞質(zhì)膜連接及其生理學(xué)重構(gòu)[20]。CLASP2可調(diào)節(jié)細胞損傷和細胞周期，在大腦皮層發(fā)育中負責(zé)協(xié)調(diào)Reelin通路功能和細胞骨架形成[21]。GSK3可介導(dǎo)CLASP2磷酸化繼而調(diào)節(jié)著絲粒[22]?？梢?，TMEM110和CLASP2均與細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)，但二者與惡性黑色素瘤的關(guān)系尚未明確。

考慮目前基因芯片及高通量測序等測序技術(shù)的經(jīng)濟成本較高，本研究通過篩選GEO數(shù)據(jù)庫中的資料進行二次分析，所得結(jié)果與真實情況難免有一定差異，上述分析結(jié)果未來仍需在實驗室中進一步驗證。