趙瑩瑩，賈艷艷，杜付玉，余祖華，廖成水，何 雷，李銀聚，張春杰

(1.河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南洛陽471000；2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南洛陽471000)

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種革蘭氏陽性的人畜共患致病菌，能夠穿透人體及動物的腸道、血腦和胎盤屏障，感染后可以引發(fā)早產(chǎn)或流產(chǎn)，腦膜炎，敗血癥和腦炎等癥狀，死亡率高達30 %～70 %[1]。由LM 引起的食物中毒的情況日趨嚴重，已引起各國相關(guān)組織的高度重視。

LM 進入機體后，可以感染肝細胞、巨噬細胞和DC 等多種細胞。這些細胞表面受體能夠識別LM 表面的一系列Toll 樣受體配體，并激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，釋放前炎性細胞因子，從而發(fā)揮天然免疫應(yīng)答作用[2]。LM 感染產(chǎn)生強烈的天然免疫應(yīng)答，能夠直接或間接促進獲得性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生[3]。LM 被巨噬細胞吞噬后，大部分細菌被降解，其抗原表位遞呈給MHCⅡ類分子，誘導(dǎo)CD4+T 細胞免疫應(yīng)答。部分細菌通過1isteriolysin O (LLO)的溶膜作用逃離吞噬體進入胞漿，其抗原表位遞呈給MHCⅠ類分子，誘導(dǎo)CD8+T 細胞免疫應(yīng)答，這種獨特免疫應(yīng)答機制使減毒LM 成為一種具有吸引力的疫苗載體[4-5]。

由hly基因編碼的LLO 是一個最重要的毒力因子[6-8]。溶血素是一種分泌性蛋白，由505 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為56 000 ku。該蛋白具有形成孔道的特性，能夠裂解細胞內(nèi)的吞噬體膜，使LM逃離吞噬體進入胞液，促進細菌在細胞胞內(nèi)的增殖[9]。

為開發(fā)安全有效的LM 疫苗，本研究通過對hly基因序列分析和查閱文獻[10]，發(fā)現(xiàn)hly基因序列的112 bp～153 bp 屬于重要毒力區(qū)，因此對hly基因的這一段編碼序列進行敲除，構(gòu)建LM△hly112-153缺失菌株，從溶血能力、對巨噬細胞的侵襲能力等方面研究LM△hly112-153的生物學(xué)特性，并評價其對小鼠的免疫保護力，從而為開發(fā)LM 減毒疫苗奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 李斯特菌野生菌株LM10403S、小鼠單核巨噬細胞J774A.1、pKSV7 穿梭載體和大腸桿菌DH5α 均由河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室保存；pMD19-T 克隆載體、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶和各種限制性內(nèi)切酶、X-Gal 及IPTG 均購自TaKaRa 公司；細菌基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；6周齡～8 周齡BALB/c 雌性小鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的hly基因序列(ID：987033)設(shè)計引物(表1)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 本實驗所需的引物Table 1 The sequence of primer pairs used to amplify related genes

1.3 重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb的構(gòu)建與鑒定 參照細菌基因組抽提試劑盒說明抽提野生菌株LM 基因組DNA，分別用引物hlya1/hlya2 和hlyb1/hlyb2 擴增hly基因的上下游同源臂。以回收的hlya 和hlyb片段為模板，通過引物hlya1 和hlyb2，采用重疊延伸PCR (SOEing PCR)的方法將hlya、hlyb 拼接成hlya-hlyb，按照DNA 凝膠回收試劑盒程序回收hlya-hlyb 片段。

將回收得到的hlya-hlyb 片段克隆于pMD19-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-hlya-hlyb，經(jīng)雙酶切和測序鑒定。

用KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切pMD19-T-hlya-hlyb，將回收到的酶切產(chǎn)物hlya-hlyb 克隆于pKSV7 載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α。挑取單菌落擴大培養(yǎng)后抽提重組質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pKSV7-hlya-hlyb。

1.4 LM△hly112-153缺失株的構(gòu)建 采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb導(dǎo)入LM 感受態(tài)細胞中，通過在42 ℃和氯霉素雙重抗性壓力下實現(xiàn)同源重組，由于pKSV7 是溫度敏感型穿梭質(zhì)粒，將其在無抗性壓力下傳代，以消除載體，最終實現(xiàn)hly毒力區(qū)42 bp 片段的缺失，獲得在氯霉素抗性下不能生長的菌株，然后以此菌株為模板，用引物hlya1/hlyb2 進行PCR 擴增鑒定，鑒定正確的菌株由北京華大基因有限公司進行測序，并命名為LM△hly112-153。

1.5 LM△hly112-153溶血活性的測定 將LM、LM△hly112-153接種BHI 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h 后離心取上清，用PBS 調(diào)整二者至OD600nm相同，用PBS將LM、LM△hly112-153菌液2 倍倍比稀釋至210，同時以PBS 作為陰性對照，分別加70 μL 至96 孔V 型板中，然后每孔加入30 μL 1 %綿羊紅細胞，微振蕩混勻，37 ℃培養(yǎng)1 h 后觀察二者的溶血情況。

1.6 LM△hly112-153對巨噬細胞J774.1 侵襲率的測定 將J774.1 細胞以2.0×105cells/孔接種于24 孔板，培養(yǎng)至單層細胞后，改用不含雙抗、含10 %FCS 的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)2 h；將LM 及LM△hly112-153按MOI為100∶1 分別感染J774.1 細胞，作用2 h；PBS 洗3 次后加入含慶大霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基作用1.5 h；PBS 洗3 次，用0.1 % Triton-100裂解細胞，裂解液稀釋后取100 μL 涂布于BHI 培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)統(tǒng)計分析LM△hly112-153對巨噬細胞J774.1 的侵襲率。

1.7 LM△hly112-153對小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定取對數(shù)生長期的LM△hly112-153與LM 懸浮菌液6 000 r/min 離心3 min，PBS 洗滌重懸后測定其OD600nm，根據(jù)預(yù)試驗選取合適的稀釋度，具體稀釋度見表2。每個稀釋度腹腔注射5 只6 周齡BALB/c 小鼠，每只小鼠注射劑量為100 μL，并設(shè)無菌PBS 為空白對照組。觀察2 周，記錄小鼠死亡情況，采用Bliss 方法計算基因缺失株和野生株對BALB/c 小鼠的LD50[11]。

1.8 LM△hly112-153對小鼠免疫保護率的測定 將24只6 周齡BALB/c 小鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組用0.1 LD50LM△hly112-153免疫，分別于第1 d和第8 d 以LM△hly112-153100 μL/只(4.0×107cfu)腹腔注射免疫小鼠，對照組每只小鼠腹腔注射100 μL PBS。在二免后第8 d 分別對實驗組和對照組小鼠100 μL/只(1.0×106cfu)腹腔注射野生菌株。攻毒后持續(xù)觀察記錄免疫小鼠生長及死亡情況，評價LM△hly112-153的免疫保護效果。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb的構(gòu)建與鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-hlya-hlyb與pKSV7經(jīng)KpnⅠ/XbaⅠ雙酶切回收后，連接、轉(zhuǎn)化至DH5α，抽提重組質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)物出現(xiàn)約7 000 bp 和1 300 bp 兩條目的帶，與預(yù)期相符(圖1)，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb。

圖1 重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb 的酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pKSV7-hlya-hlyb

2.2 LM△hly112-153缺失株的篩選與鑒定 將重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-hlyb 電轉(zhuǎn)化至LM 感受態(tài)細胞中，通過在42 ℃和氯霉素抗性壓力的雙重篩選實現(xiàn)同源重組，利用引物hlya1/hlyb2 對疑似重組菌株進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物測序后結(jié)果顯示hly基因序列少了42 bp 的目標(biāo)毒力區(qū)，與預(yù)期結(jié)果相符，表明正確構(gòu)建出LMhly基因缺失株LM△hly112-153。

2.3 LM△hly112-153溶血活性測定結(jié)果 將PBS 以及倍比稀釋后的LM、LM△hly112-153菌液于96 孔V 型板中與30 μL 1 %綿羊紅細胞互作，結(jié)果顯示，LM△hly112-153的溶血效價為26，野生株LM 的溶血效價為24(圖2)，表明hly112-153基因的缺失導(dǎo)致LM 溶血效價的降低，但并未導(dǎo)致其編碼的毒力因子LLO 的溶血活性完全失活。

圖2 LM△hly112-153 的溶血性試驗Fig.2 Hemolytic test of LM△hly112-153

2.4 LM△hly112-153對巨噬細胞J774.1 的侵襲率的測定 將LM 及LM△hly112-153分別感染J774.1 細胞，檢測LM 和LM△hly112-153對巨噬細胞J774.1 的侵襲能力。結(jié)果顯示，LM 和LM△hly112-153對J774.1 的侵襲率分別為13.9 %和0.46 %，LM△hly112-153對J774.1細胞的侵襲能力極顯著低于野生株(p<0.01)(圖3)，表明hly基因在LM 侵襲細胞過程中發(fā)揮著重要作用。

圖3 野生菌株和缺失菌株對J774.1 細胞侵襲能力的比較Fig.3 Comparison of invasive abilities between wild and deleted strains to J774.1 cells

2.5 LM△hly112-153對小鼠LD50的測定結(jié)果 對實驗小鼠腹腔注射不同稀釋度的LM △hly112-153，通過Bliss 法計算其LD50為4.253×108cfu，高于野生株LM 3 個數(shù)量級(表2)，表明hly部分基因敲除后，LM△hly112-153的毒力顯著下降。

表2 LM 菌株對BALB/c 小鼠的LD50 測定Table 2 LD50 of LM strains for BALB/c mice

2.6 LM△hly112-153對小鼠免疫保護率的測定 LM△hly112-153二免8 d 后采用1.0×106cfu/只對LM 小鼠攻毒，結(jié)果顯示對照組小鼠于攻毒后7 d 內(nèi)全部死亡，實驗組7 d 內(nèi)死亡3 只小鼠，8 d～15 d 死亡1只，其余11 只小鼠存活至觀察期結(jié)束，并且存活小鼠精神狀態(tài)良好，免疫保護率為75 % (表3)。表明該基因缺失株安全性好，并且能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生較好的免疫保護效果。

表3 LM△hly112-153 對BALB/c 小鼠免疫保護率的測定Table 3 Determination of immunoprotection rate of BALB/c mice by LM△hly112-153

3 討 論

減毒LM 是兼性胞內(nèi)菌，能夠運送抗原進入MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類抗原加工、提呈途徑，誘導(dǎo)強烈的CD8+T 細胞免疫應(yīng)答和CD4+T 細胞免疫應(yīng)答，并且能夠刺激細胞產(chǎn)生較多的IFN-γ、IL-18、IL-12 等細胞因子，目前已被證實是一種理想的外源抗原表達載體[12-13]。作為疫苗載體，安全性至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，LM 基因組有多個毒力因子，其中由hly編碼的LLO 是一種穿孔毒素，能夠溶解宿主細胞內(nèi)吞小體膜，使細菌逃離吞噬體，進入胞漿，從而避免被吞噬細胞殺傷，這是細菌得以在胞質(zhì)內(nèi)增殖的先決條件。LM10403S 是遺傳背景較清晰的李斯特菌標(biāo)準強毒菌株，因此本研究以標(biāo)準株LM10403S 為研究對象，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建出hly基因缺失菌株LM△hly112-153，對其生物學(xué)特性進行分析，并評價了該基因缺失株的免疫保護效果。

考慮到細菌安全性與侵襲性的平衡，在構(gòu)建缺失菌株時，本研究通過對hly基因序列分析，最終確定hly基因112 bp～153 bp 基因序列為目標(biāo)刪除序列，通過同源重組技術(shù)對該毒力區(qū)進行了缺失。試驗分析了LM△hly112-153對巨噬細胞的侵襲能力，結(jié)果顯示與野生菌株LM 相比，LM△hly112-153的胞內(nèi)侵襲率下降約96 %，表明hly基因部分缺失降低了細菌對巨噬細胞侵襲性。為進一步確認該基因缺失株的毒力，本研究進行了小鼠攻毒試驗，結(jié)果顯示基因缺失株的毒力比野生菌株降低了3 個數(shù)量級，表明hly基因缺失引起細菌的毒力顯著降低。

LLO 是LM 逃脫吞噬體的重要蛋白，在細胞溶血性試驗中發(fā)現(xiàn)LLO 部分毒力區(qū)的缺失導(dǎo)致細菌溶血活性降低了2 個滴度，但并未使LM△hly112-153中LLO 活性完全喪失，這些結(jié)果表明LM△hly112-153仍可能通過LLO 的溶膜作用逃離吞噬體而進入胞漿中，并將其抗原表位遞呈給MHCⅠ類分子，誘導(dǎo)CD8+T 細胞免疫應(yīng)答。同時免疫保護實驗結(jié)果顯示，LM△hly112-153免疫后的小鼠能夠抵抗野生菌株LM 的攻擊，免疫保護率達75 %，這為LM△hly112-153作為防控李斯特菌病的候選疫苗奠定良好的研究基礎(chǔ)。

本研究通過重組自殺性質(zhì)粒構(gòu)建了減毒李斯特hly基因缺失菌株LM△hly112-153，并分析了其生物學(xué)特性和免疫保護力。研究結(jié)果顯示基因缺失株毒力比野生菌株顯著降低，安全性好，且對小鼠產(chǎn)生較好的免疫保護效果。本研究對李斯特菌病的防控研究和減毒LM 疫苗的研發(fā)具有重要意義。