覃 飛，趙杰修，王松濤，郝選明*

流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究表明，急性極限運(yùn)動(dòng)、無運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的機(jī)體參與強(qiáng)度過大的運(yùn)動(dòng)，以及長(zhǎng)期大強(qiáng)度訓(xùn)練均能導(dǎo)致不同程度的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制（exercise-induced immunosuppression，EIS）（Gleeson et al.，2013；Walsh et al.，2011）。已有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的EIS是整體性的，其影響可涉及免疫細(xì)胞的數(shù)量（Sugama et al.，2015；Walsh et al.，2011）、淋巴細(xì)胞亞群的比例（王茹 等，2009；Saito et al.，2003）、淋巴細(xì)胞增殖與分化能力（李玉周 等，2010）、抗體的分泌（Colbey et al.，2018）、細(xì)胞因子的合成與釋放（Kakanis et al.，2014）、免疫器官的結(jié)構(gòu)與功能（丁響 等，2016；張馨蕾 等，2015）等多方面，即過度訓(xùn)練可造成免疫細(xì)胞、免疫組織、免疫器官和調(diào)節(jié)因子等多個(gè)層面的損傷或失衡。同時(shí)，過度訓(xùn)練對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響也是一個(gè)漸進(jìn)性的動(dòng)態(tài)過程（Gleeson et al.，2013；Walsh et al.，2011）。因此，無論是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響，還是研究EIS的各種調(diào)理手段，都應(yīng)該從整體性和動(dòng)態(tài)性出發(fā)。

既往研究和實(shí)踐中已應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)、中藥和針灸理療等多種手段調(diào)理EIS。但多方面的原因而制約了它們?cè)趯?shí)踐中的應(yīng)用（如安全劑量問題、效果不確定、興奮劑風(fēng)險(xiǎn)、技術(shù)要求較高等）。20世紀(jì)60年代初，激光生物學(xué)的研究開始興起。到目前，低強(qiáng)度激光不僅在炎癥、常見慢性病、腫瘤等多種疾病的臨床治療中得以應(yīng)用，而且在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也開展了系列研究和實(shí)踐探索，尤其是在運(yùn)動(dòng)損傷的治療與康復(fù)方面（Vanin et al.，2018）。但低強(qiáng)度激光在EIS調(diào)理中的應(yīng)用尚處于起步階段，缺乏充足的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)激光屬于物理干預(yù)手段，對(duì)運(yùn)動(dòng)員不存在興奮劑的風(fēng)險(xiǎn)，可作為職業(yè)運(yùn)動(dòng)員和運(yùn)動(dòng)愛好者機(jī)能強(qiáng)化和相關(guān)疾病治療的一種潛力手段。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證明和完善。

本研究以6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練大鼠為動(dòng)物模型，以不同照射劑量的低強(qiáng)度激光為干預(yù)手段，通過檢測(cè)反映機(jī)體整體免疫機(jī)能的指標(biāo)（白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子含量、抗體和補(bǔ)體濃度、淋巴細(xì)胞增殖能力、免疫器官形態(tài)結(jié)構(gòu)等）的動(dòng)態(tài)變化（第0、2、4、6周），觀察和評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)和激光對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響，并比較不同劑量組激光照射的干預(yù)效果，探討EIS的發(fā)生發(fā)展過程以及低強(qiáng)度激光的調(diào)理方法和效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠（雄性，8周齡，體重238±34 g）104只，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。標(biāo)準(zhǔn)飼料和環(huán)境飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律。隨機(jī)分為安靜對(duì)照組［control（C），32只］、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組［exercise （E），24只］、運(yùn)動(dòng)和小劑量激光干預(yù)組［exercise + low level laser （E+LL），24只］、運(yùn)動(dòng)和大劑量激光干預(yù)組［exercise + high level laser （E+HL），24只］。各運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練。訓(xùn)練計(jì)劃開始前24 h隨機(jī)選取C組大鼠8只，取材測(cè)試，作為各組大鼠正式訓(xùn)練前（Week0）的基礎(chǔ)對(duì)照值。訓(xùn)練開始后分別于2nd、4th、6th周的末次運(yùn)動(dòng)后48 h，運(yùn)動(dòng)各組隨機(jī)選取8只大鼠處死取材測(cè)試，將取材時(shí)間點(diǎn)分別記為Week2、Week4和Week6。

1.2 干預(yù)手段

1.2.1 運(yùn)動(dòng)方案

6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練方法（覃飛 等，2012；張琳 等，2012）：跑臺(tái)，坡度0°，遞增跑速（第1周為10 m/min，第2周為20 m/min，從第3周開始，跑臺(tái)速度每周遞增5 m/min，直至第6周達(dá)到40 m/min）。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參照文獻(xiàn)（H?ydal et al.，2007），并利用Oxymax大鼠代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（Columbus，USA）進(jìn)行確定。每次運(yùn)動(dòng)30 min，每天1次，每周6次，周日休息，共持續(xù)6周。

1.2.2 低強(qiáng)度激光照射方案

采取鼻腔外照射（劉承宜 等，2009）氦氖激光（632.8 nm），光斑面積0.018 cm2。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后2 h對(duì)大鼠進(jìn)行不同劑量的低強(qiáng)度激光照射。單手固定大鼠，光纖探頭照射鼻甲兩側(cè)，每次2 min，每日1次，每周6次，共6周。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定本研究的照射劑量，小劑量組（E+LL）輻射功率1 mw，能量密度6.8 J/cm2，功率密度0.06 mw/cm2；大劑量組（E+HL）輻射功率2 mw，能量密度13.6 J/cm2，功率密度0.12 mw/cm2。單純運(yùn)動(dòng)組（E）和安靜對(duì)照組（C）進(jìn)行模擬激光照射（操作時(shí)激光光源處于關(guān)閉狀態(tài)）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 取材

分別于訓(xùn)練計(jì)劃開始前24 h（0周），訓(xùn)練開始后第2、4、6周的末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后48 h，各運(yùn)動(dòng)組大鼠隨機(jī)選取8只，處死并取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，75%乙醇全身消毒，超凈工作臺(tái)內(nèi)取材。腹主動(dòng)脈取血部分用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)試，其余制備血清（4 000 r/min，離心20 min），分裝后置于-80℃冰箱保存待測(cè)。摘取脾臟，稱重，剪取3/4放入裝有已滅菌PBS的EP管中，用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，剩余1/4置于固定液中固定。摘取大鼠胸腺（稱重）和股骨，剔除周圍結(jié)締組織，置于10%中性甲醛中固定。

1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)

利用日本光電Mek-7222k全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀及相關(guān)大鼠血細(xì)胞檢測(cè)分析軟件進(jìn)行白細(xì)胞五分類測(cè)試。利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中免疫球蛋白IgM、IgG及補(bǔ)體C3、C4含量。使用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清中CRP、IL-10、TNF-α含量。

1.3.3 T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

無菌摘取脾臟后放入PBS溶液中，置于200目篩網(wǎng)上輕輕研磨，利用淋巴細(xì)胞分層液提取淋巴細(xì)胞。低溫離心，洗滌細(xì)胞2次，懸浮于PBS中，400目尼龍網(wǎng)過濾。以RPMA-1640培養(yǎng)液重懸，配置成1×107cells/ml的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞及刀豆蛋白A（ConA）100 μl，ConA終濃度為10 μg/ml。37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8試劑20 μl，孵育4 h，酶標(biāo)儀（450 nm）檢測(cè)光密度值。

1.3.4 HE染色

將固定48 h后的胸腺和脾臟常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋連續(xù)切片，片厚5 μm，HE染色，中性樹脂封片。股骨固定48 h后置于EDTA脫鈣液中（每2天換一次脫鈣液），5周完成脫鈣。流水沖洗標(biāo)本，延股骨額狀面中央縱剖。進(jìn)行組織脫水、制片，具體步驟同上。運(yùn)用Motic光學(xué)顯微鏡和彩色數(shù)碼CCD攝像頭進(jìn)行形態(tài)學(xué)圖像采集，分別在4×10、10×10、40×10倍視野下觀察胸腺、脾臟和骨髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)以M±SD表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有測(cè)試指標(biāo)的數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。首先將E與C組進(jìn)行比較，以探討長(zhǎng)期大強(qiáng)度訓(xùn)練對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響。然后對(duì)比E、E+LL和E+HL 3組，探討不同劑量的激光對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制發(fā)展過程的調(diào)理效果差異。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過程中，各組之間的比較均采用多因素方差分析的方法，分別分析干預(yù)措施（運(yùn)動(dòng)/激光）的主效應(yīng)、時(shí)間的主效應(yīng)，以及兩者之間的交互效應(yīng)。當(dāng)交互效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再進(jìn)一步采用One-Way ANOVA進(jìn)行主效應(yīng)分析（simple main effect），并采用LSD選項(xiàng)進(jìn)行各組間的兩兩比較，顯著性水平取P＜0.05。

2 研究結(jié)果

本研究在干預(yù)前（0周）和干預(yù)過程中（第2、4、6周末）分別采集各組大鼠的血液，檢測(cè)血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、免疫球蛋白和補(bǔ)體含量（IgM、IgG、C3、C4）、炎癥因子含量（IL-10、TNF-α、IL-10/TNF-α、CRP），并評(píng)價(jià)脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力。經(jīng)多因素方差分析顯示，各指標(biāo)的干預(yù)措施主效應(yīng)、時(shí)間主效應(yīng)，以及它們之間的交互效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且中樞和外周免疫器官的形態(tài)在各組之間和各采樣時(shí)間點(diǎn)之間也存在明顯的變化。說明，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體的免疫機(jī)能發(fā)生變化，不同劑量的激光照射對(duì)這些變化的影響程度不同。

2.1 血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的變化

本研究對(duì)血液中白細(xì)胞進(jìn)行了五分類（LY、NE、MO、BA、EO）計(jì)數(shù)，其中單核細(xì)胞、嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞在整個(gè)6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中各組大鼠均未出現(xiàn)明顯變化，而白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞（LY）與中性粒細(xì)胞（NE）及其比例存在顯著改變（圖1）。E組從訓(xùn)練的第2周開始，WBC和NE（NE%）進(jìn)行性上升，而LY（LY%）進(jìn)行性下降。兩個(gè)劑量的低強(qiáng)度激光干預(yù)組均可延緩WBC、NE（NE%）和LY（LY%）的上述變化趨勢(shì)，且在訓(xùn)練的后期（第4～6周）E+LL組的效果明顯優(yōu)于E+HL組（P＜0.01）。

2.2 T淋巴細(xì)胞增殖能力變化

6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練期間，E組大鼠T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加逐周下降。6周末與0周相比下降29%（P＜0.01）。而E+LL組和E+HL組在訓(xùn)練初期（WK0～WK2）顯著下降，隨后E+HL組逐周回升，至6周訓(xùn)練結(jié)束時(shí)，顯著高于E組（升高23%，P＜0.01）和E+LL組（升高11%，P＜0.05）。E+LL組4周末時(shí)較2周末有所回升，且顯著高于E組，6周末時(shí)又略有下調(diào)，但仍顯著高于E組（升高11%，P＜0.05，圖2）。

2.3 免疫球蛋白及補(bǔ)體變化

6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中，E組和E+LL組IgM含量隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加。6周末時(shí)E組和E+LL組顯著高于0周基礎(chǔ)值（均升高40%，P＜0.01）。而E+HL組于訓(xùn)練初期顯著升高（P＜0.05），隨后逐周下降，4周末和6周末時(shí)顯著低于E組和E+LL組（均下降19%，P＜0.05）。6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中，運(yùn)動(dòng)各組IgG變化趨勢(shì)相似：訓(xùn)練初期顯著降低（P＜0.01），訓(xùn)練中期與后期顯著升高（P＜0.01），其中E組增加幅度最大（6周與0周相比升高20%，P＜0.01）。6周末時(shí)，E+LL組顯著低于E組和E+HL組（均下降6%，P＜0.01，表1）。

圖1 各組大鼠WBC、NE和LY含量及百分比變化Figure 1. The Changes of WBC，NE，and LY in Rats in Different Groups

表1 各組大鼠免疫球蛋白和補(bǔ)體變化情況Table 1 The Changes of Immunoglobulin and Complement of Serum in Different Groups g/L

圖2 各組大鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力的變化Figure 2. The Changes of Proliferation Function of T Lymphocyte of Spleen in Different Groups

補(bǔ)體的數(shù)據(jù)顯示，E組和E+HL組補(bǔ)體C3在訓(xùn)練中期顯著升高（P＜0.01）。E+LL組增幅較?。≒＜0.05），且顯著低于E組（下降24%，P＜0.01）和E+HL組（下降28%，P＜0.01）。各運(yùn)動(dòng)組補(bǔ)體C4在訓(xùn)練中期和后期不同程度增加，至6周末時(shí)E組和E+HL組較0周均顯著升高150%（P＜0.05），而E+LL組增幅不顯著，在6周末時(shí)顯著低于E組和E+HL組（均下降30%，P＜0.01，表1）。

2.4 炎癥因子變化

圖3顯示，E組在6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中，TNF-α和CRP進(jìn)行性上升，IL-10/TNF-α進(jìn)行性下降。E+LL組可縮小上述指標(biāo)的變化幅度，但E+HL組對(duì)TNF-α和IL-10/TNF-α的上述變化影響不顯著，且使CRP的上述變化進(jìn)一步擴(kuò)大。

訓(xùn)練初期E組（下降45%，P＜0.01）和E+LL組（下降28%，P＜0.01）血清IL-10含量顯著下降。訓(xùn)練中期和后期，各運(yùn)動(dòng)組不同程度增加。6周末時(shí)，E+LL組顯著高于E組（升高39%，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠血清相關(guān)炎癥因子的變化Figure 3. The Changes of Cytokine of Serum in Different Groups

2.5 免疫器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

2.5.1 中樞免疫器官（胸腺和骨髓）的形態(tài)變化

圖4顯示，C組各周胸腺變化不明顯，與圖A1、B1、C1相似。胸腺結(jié)構(gòu)完整，皮髓質(zhì)界限清晰。皮質(zhì)細(xì)胞均勻密集，髓質(zhì)內(nèi)上皮細(xì)胞連接形成的網(wǎng)狀細(xì)胞清晰完整。2周末，各運(yùn)動(dòng)組（A2、B2、C2）的胸腺皮髓質(zhì)界限清晰，但皮質(zhì)中出現(xiàn)斷裂帶，細(xì)胞密度下降且分布不均。4周末，E組（A3）胸腺皮髓質(zhì)界限模糊，髓質(zhì)內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，細(xì)胞間空隙增大，部分出現(xiàn)皮髓質(zhì)交叉融合現(xiàn)象。E+LL組（B3）和E+HL組（C3）皮髓質(zhì)界限清晰，且E+LL組細(xì)胞密度與2周相比有所增加。6周訓(xùn)練結(jié)束后，E組（A4）和E+HL組（C4）胸腺皮髓質(zhì)交叉融合，斷裂帶非常明顯，上皮細(xì)胞散在，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，部分存在出血。而E+LL組（C4）雖也出現(xiàn)斷裂帶，但皮髓質(zhì)界限清晰可見。

圖4 各組大鼠胸腺HE染色（HE×400）Figure 4. The Histomorphology of Thymus in Rats in Different Groups

圖5顯示，C組大鼠在各采樣時(shí)點(diǎn)骨髓造血組織結(jié)構(gòu)完整，造血細(xì)胞豐富且均勻填充在骨髓腔內(nèi)，血竇清晰可見（與圖5-A1、B1、C1結(jié)構(gòu)相似）。2周末各運(yùn)動(dòng)組（A2、B2、C2）骨髓中造血細(xì)胞減少，骨髓支架中空腔增多，且向中心聚集。4周末各運(yùn)動(dòng)組的骨髓中造血細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的增加，其中E+LL組（B3）改善最為明顯。6周末E組（A4）和E+HL組（C4）造血細(xì)胞減少，骨髓腔空腔增大，而E+LL組（B4）與0周相比空腔仍較多，但造血細(xì)胞密度明顯高于E組和E+HL組，且與4周相比分布均勻。

2.5.2 外周免疫器官（脾臟）的形態(tài)變化

圖6顯示，C組脾臟形態(tài)各采樣時(shí)點(diǎn)無顯著變化，與0周安靜對(duì)照組（A1、B1、C1）形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。被膜、白髓（呈紫色）、紅髓（呈粉紅色）和邊緣區(qū)界限清晰，中央動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，脾小結(jié)明顯，多為初級(jí)濾泡。2周末時(shí)，各運(yùn)動(dòng)組（A2、B2、C2）的脾臟細(xì)胞密度明顯下降，脾臟白髓處出現(xiàn)不同程度的斷裂帶，但白髓、紅髓和邊緣區(qū)界限依然清晰，3組無顯著差異。4周末時(shí)，E組（A3）白髓、紅髓和邊緣區(qū)界限趨于模糊，細(xì)胞密度無明顯改善，而E+LL組（B3）和E+HL組（C3）脾臟內(nèi)細(xì)胞密度雖無明顯改善，但白髓和紅髓界限較清晰。6周末時(shí)，E組（A4）和E+LL組（B4）脾臟白髓、紅髓和邊緣區(qū)界限的清晰度下降，部分出現(xiàn)紅白髓交差融合現(xiàn)象，而E+HL組（C4）脾臟紅白髓界限清晰可見。

3 分析與討論

本研究通過動(dòng)態(tài)觀察（0、2、4、6周）血常規(guī)、免疫細(xì)胞因子、免疫球蛋白、補(bǔ)體、T淋巴細(xì)胞的增殖能力，以及中樞和外周免疫器官的形態(tài)等指標(biāo)的變化，試圖探討長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響。如結(jié)果所示，訓(xùn)練初期（WK0～WK2），由于機(jī)體對(duì)訓(xùn)練的啟動(dòng)和負(fù)荷增加的不適應(yīng)，可產(chǎn)生暫時(shí)性的免疫機(jī)能下降（表現(xiàn)為CRP升高、IL-10及IL-10/TNF-α下降、T淋巴細(xì)胞刺激轉(zhuǎn)化率下降、IgG下降和免疫器官形態(tài)的改變等），提示大鼠出現(xiàn)暫時(shí)性的免疫抑制。訓(xùn)練中后期（WK2～WK6），由于運(yùn)動(dòng)負(fù)荷進(jìn)一步遞增以及不施加休息或減量訓(xùn)練調(diào)整，大鼠中性粒細(xì)胞（NE和或NE%）上升和淋巴細(xì)胞（LY和或LY%）下降程度加重，炎癥因子（CRP和TNF-α）升高明顯，T淋巴細(xì)胞增殖功能持續(xù)下降，胸腺和脾臟形態(tài)的破壞進(jìn)一步加重，說明大鼠產(chǎn)生累積性免疫抑制。這一階段運(yùn)動(dòng)機(jī)體免疫機(jī)能大幅度下降，對(duì)感染性疾病易感性增高（王建枝 等，2015；Ziv-Baran et al.，2017）。

圖5 各組大鼠骨髓HE染色（HE×100）Figure 5. The Histomorphology of Bone Marrow in Rats in Different Groups

圖6 各組大鼠脾臟HE染色（HE×100）Figure 6. The Histomorphology of Spleen in Rats in Different Groups

本研究前期已應(yīng)用同一運(yùn)動(dòng)模型，分別從中樞和外周免疫器官的變化等不同層面，探討了運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的機(jī)制。研究提示，長(zhǎng)期大強(qiáng)度遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷訓(xùn)練可能會(huì)導(dǎo)致胸腺細(xì)胞周期阻滯（張馨蕾 等，2015）、骨髓B細(xì)胞發(fā)育障礙（耿青青，2012）、免疫細(xì)胞歸巢及發(fā)育受阻（張琳 等，2013）等。這不僅在一定程度上解釋了運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的機(jī)制，也進(jìn)一步說明，大鼠6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練模型是探討運(yùn)動(dòng)性免疫抑制表現(xiàn)、機(jī)制以及干預(yù)效果的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

為有效干預(yù)運(yùn)動(dòng)人群的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制，我們選取了低強(qiáng)度激光治療作為主要干預(yù)方式進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。低強(qiáng)度激光通常是指波長(zhǎng)在600～1 000 nm的單色光，具有低輸出能量、低光熱等效應(yīng)，能產(chǎn)生某種類似超聲波和針灸等物理因子的光生物調(diào)節(jié)作用，可緩解疼痛、消除炎癥、促進(jìn)愈合（劉承宜 等，2009）。既往研究已經(jīng)在人體、動(dòng)物、細(xì)胞等多層面發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度激光照射可增加免疫細(xì)胞的數(shù)量并改善細(xì)胞因子的合成與分泌（朱平 等，2011； El Gammal et al.，2017；Garcia et al.，2014）。但目前仍然缺乏針對(duì)運(yùn)動(dòng)機(jī)體（人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物）來探討運(yùn)動(dòng)性免疫抑制激光調(diào)理的相關(guān)研究。同時(shí)，研究和實(shí)踐也發(fā)現(xiàn)，激光照射對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)存在適宜的能量范圍，最佳能量密度可改善機(jī)體免疫功能，劑量過大則產(chǎn)生相反的效果，造成免疫功能抑制（劉承宜 等，2009；朱平 等，2011）。因此，本研究探討了不同劑量的低強(qiáng)度激光鼻部照射對(duì)EIS發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)理作用。

免疫細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用低強(qiáng)度激光進(jìn)行調(diào)理，小劑量組在訓(xùn)練的中期和后期呈現(xiàn)明顯的調(diào)理效果，且在6周末時(shí)明顯優(yōu)于大劑量組。而大劑量組在訓(xùn)練中期調(diào)理效果顯著，但訓(xùn)練后期部分效果消失（NE%、LY%），提示，隨著照射時(shí)程的延長(zhǎng)，大劑量組的激光累積效應(yīng)增加，可能偏離最適累積劑量范圍而導(dǎo)致效果喪失。

血清細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRP對(duì)激光劑量反應(yīng)敏感。大劑量激光與運(yùn)動(dòng)可產(chǎn)生強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)，表現(xiàn)為大劑量激光組CRP與單純運(yùn)動(dòng)組同步變化且顯著高于單純運(yùn)動(dòng)組。而小劑量激光組在訓(xùn)練初期就表現(xiàn)出對(duì)CRP的下調(diào)作用，雖訓(xùn)練中后期CRP含量有所上升，但在6周末仍顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組。分析低強(qiáng)度激光的調(diào)理效果，綜合考慮IL-10、TNF-α及其比值，本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量激光組在6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中，隨著照射時(shí)程的延長(zhǎng)，調(diào)理功能逐漸增大（參考各階段變化曲線的斜率），而大劑量激光組在訓(xùn)練的中期調(diào)理功能最強(qiáng)，訓(xùn)練后期下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大劑量低強(qiáng)度激光可能具有照射時(shí)程（或累積劑量）的拋物線效應(yīng)，存在最佳時(shí)程（或最佳累積劑量）范圍。因此，應(yīng)用不同劑量的激光干預(yù)時(shí)要考慮療程和累積劑量的問題，尤其是大劑量低強(qiáng)度激光。

細(xì)胞免疫方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激光對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖能力具有調(diào)節(jié)作用（朱平 等，2011；El Gammal et al.，2017），這可能是激光產(chǎn)生的光生物效應(yīng)激活了淋巴細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路中的相關(guān)酶和受體，影響了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)（Ejiri et al.，2014）。體液免疫方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小劑量激光治療組對(duì)IgM未呈現(xiàn)明顯的調(diào)理作用，但在6周末時(shí)對(duì)IgG調(diào)理有效。大劑量激光治療組在遞增負(fù)荷訓(xùn)練的中后期對(duì)IgM調(diào)理有效，而對(duì)于IgG在訓(xùn)練中期調(diào)理有效，后期效果消失，提示IgM和IgG對(duì)激光照射的應(yīng)答具有強(qiáng)度依賴性，且隨著照射時(shí)程的延長(zhǎng)，調(diào)理作用減弱（尤其是大劑量激光）。一些針對(duì)其他健康問題的研究也提供了激光對(duì)體液免疫具有調(diào)理作用的證據(jù)。張紅宇等（2001）研究表明，激光穴位照射可有效提高胃癌病人術(shù)后血清IgG、IgM、IgA含量。侯曉強(qiáng)等（2005）發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度激光血管照射可有效升高吸毒人員血清IgG、IgM含量。綜合上述研究，我們認(rèn)為激光治療可有效下調(diào)或上調(diào)機(jī)體感染而導(dǎo)致的IgM和IgG分泌水平變化。這也證明了朱平等人提出的理論假說：低強(qiáng)度激光具有雙向調(diào)節(jié)作用，其治療的主旨是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生光生物效應(yīng)，進(jìn)而對(duì)失衡的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其恢復(fù)穩(wěn)態(tài)或重建新的穩(wěn)態(tài)（劉承宜 等，2009；朱平 等，2011）。

此外，低強(qiáng)度激光對(duì)6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練大鼠中樞免疫器官（胸腺和骨髓）形態(tài)破壞的改善作用表現(xiàn)為訓(xùn)練初期效果不明顯，訓(xùn)練中后期效果顯著，且小劑量組優(yōu)于大劑量組。而對(duì)于外周免疫器官（脾臟）則表現(xiàn)為，訓(xùn)練的中后期大劑量組效果優(yōu)于小劑量組。本研究中免疫器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變支持長(zhǎng)期遞增負(fù)荷訓(xùn)練對(duì)機(jī)體血液免疫指標(biāo)的影響以及低強(qiáng)度激光的調(diào)理效果。低強(qiáng)度激光對(duì)免疫器官的調(diào)理作用可能與其光生物效應(yīng)可維持免疫器官的微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)，激活相關(guān)細(xì)胞因子、受體和調(diào)控因子，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和免疫細(xì)胞的分化成熟與定位有關(guān)（Barboza et al.，2014；Soleimani et al.，2012；Tuby et al.，2013；Zhu et al.，2017）。本研究選用鼻腔進(jìn)行低強(qiáng)度激光照射，其主要原因在于：鼻腔內(nèi)血管網(wǎng)豐富，血流量比肝、腦和肌肉等組織相對(duì)較多。且鼻腔中含有豐富的自主神經(jīng)，刺激鼻腔內(nèi)的感受器可以反射性改變內(nèi)臟的活動(dòng)（如心、肺、胃腸道等）。此外，有研究指出，鼻黏膜固有層和黏膜下層含有很多重要的免疫組織和細(xì)胞，低強(qiáng)度激光照射可更好達(dá)到血液介導(dǎo)的局部炎癥治療到全身免疫功能改善的光生物學(xué)調(diào)節(jié)效應(yīng)（Shevrygin et al.，2000）。本研究也證實(shí)鼻部的低強(qiáng)度激光照射可產(chǎn)生全身性的光生物調(diào)節(jié)效應(yīng)，如引起循環(huán)血免疫細(xì)胞、免疫因子、抗體和補(bǔ)體，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力，以及中樞和外周免疫器官形態(tài)的改變等。既往研究中，對(duì)鼻腔和其他部位的照射，都發(fā)現(xiàn)其效應(yīng)可影響到機(jī)體的非照射部位或全身。Hentschke等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腓腸肌低強(qiáng)度激光照射，能夠使心力衰竭大鼠的全身和骨骼肌產(chǎn)生抗炎作用。Yoshimura等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，光生物調(diào)節(jié)作用可改善全身低度炎癥，降低胰島素抵抗。麻曉鴿等（2016）研究表明，低強(qiáng)度激光照射鼻腔能夠在一定程度上減輕心肌內(nèi)炎癥浸潤(rùn)和致炎性因子，降低心肌病理程度，抑制心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程?；谇捌谘芯考吧鲜鲅芯拷Y(jié)果所指出的“低強(qiáng)度激光具有全身性的光生物效應(yīng)”，本研究選取鼻腔照射，通過多指標(biāo)體系的免疫學(xué)觀察，探討低強(qiáng)度激光對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的調(diào)理效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，在6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練的初期，小劑量和大劑量的低強(qiáng)度激光均不能有效拮抗這一現(xiàn)象，提示，這一時(shí)期應(yīng)同時(shí)采取其他干預(yù)手段（如營(yíng)養(yǎng)等）或進(jìn)一步探討適宜的激光干預(yù)方案。但伴隨訓(xùn)練周期的延長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，持續(xù)的小劑量激光照射對(duì)于運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的發(fā)生發(fā)展具有顯著的改善作用。而大劑量激光在遞增負(fù)荷訓(xùn)練的中期調(diào)理效果明顯，但在訓(xùn)練后期調(diào)理能力下降，致使部分免疫指標(biāo)的改善效果減弱或消失（NE%、LY%、TNF-α、IL-10/TNF-α比值、補(bǔ)體C4、IgG），提示，大劑量激光干預(yù)可能具有照射時(shí)程（或累積劑量）的拋物線效應(yīng)，即存在最佳的時(shí)程（或累積劑量）范圍。因此，在應(yīng)用低強(qiáng)度激光調(diào)理機(jī)體免疫機(jī)能時(shí)，應(yīng)綜合考慮受試者的機(jī)能狀況和需求，以及照射部位、照射劑量和照射療程等。對(duì)于大劑量的激光，可降低照射頻率、照射時(shí)間、照射療程，以保證干預(yù)效果的最優(yōu)化。

4 結(jié)論

1）6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練模型可有效誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性免疫抑制，其免疫機(jī)能的下降是整體性和漸進(jìn)性的，表現(xiàn)為循環(huán)血中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、免疫細(xì)胞因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力，以及中樞和外周免疫器官的形態(tài)等多層面免疫學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。

2）小劑量的低強(qiáng)度激光對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的進(jìn)展具有持續(xù)的拮抗作用，大劑量的低強(qiáng)度激光在訓(xùn)練中期呈現(xiàn)一定的拮抗效果，但訓(xùn)練末期效果減弱或消失，提示，大劑量激光干預(yù)可能具有照射時(shí)程（或累積劑量）的拋物線效應(yīng)，即存在最佳的時(shí)程或累積劑量范圍。

3）大強(qiáng)度訓(xùn)練的初期和中期可選擇大劑量激光進(jìn)行干預(yù)，并采取適當(dāng)?shù)恼丈漕l率或照射時(shí)間。訓(xùn)練中期和后期應(yīng)以小劑量激光干預(yù)為主，以鞏固和加強(qiáng)干預(yù)效果。