陳 哲，黃 靜，趙 佳，梁 宏

（山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

連作障礙是許多蔬菜[1]、中藥材[2]、果樹[3]以及大田作物[4]在連年不間斷種植的情況下都會出現(xiàn)的一種現(xiàn)象，作物表現(xiàn)為生長發(fā)育不良、易感染病蟲害、產量和品質下降等[5-6]。草莓作為我國重要的園藝作物，由于耕地面積有限，大多在溫室進行連續(xù)種植，因此，面臨著嚴重的連作障礙[7-8]。

引發(fā)連作障礙的原因復雜，但其歸根結底是由于土壤環(huán)境的變化[9]。連年種植單一作物導致土壤微生物區(qū)系和多樣性失衡，有益微生物逐年減少、病原微生物逐漸富集，導致植物受到病菌侵染的概率增加[10-11]。因此，緩解連作障礙的關鍵環(huán)節(jié)之一就是調節(jié)土壤微生物的數量、活性和群落結構。

目前，生產上采取多種手段結合的綜合治理方法來處理連作土壤[12-13]，例如，首先對連作土壤進行消毒處理，殺死土壤中積累的有害微生物[14]，然后通過添加有機肥或者微生物菌劑等來改良土壤環(huán)境，不僅能增加土壤的營養(yǎng)成分，同時還能調節(jié)土壤中微生物的多樣性，滿足植物生長對于土壤環(huán)境的需求，可有效緩解連作障礙。張慶華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用棉隆消毒和生物菌肥處理草莓連作土壤，可降低微生物真菌群落的多樣性，并減少或殺死土壤中的大部分致病菌屬，起到有效防治草莓土傳病害的作用，但該研究并沒有涉及細菌多樣性的變化。

敵磺鈉又名敵克松，化學名稱為對二甲胺基苯重氮磺酸鈉，是一種常用的有殺菌作用的土壤處理劑[16]，其對真菌中腐霉菌、黑穗病菌及多種土傳病害有效，屬于保護性藥劑，目前并沒有文章報道過這類型殺菌劑對于土壤微生物多樣性的影響，也沒有其與微生物菌劑聯(lián)合使用的相關研究。

為了進一步研究克服和消除草莓連作障礙的有效方法，本研究利用MiSeq 高通量測序平臺[17-20]，選擇敵磺鈉處理與微生物菌肥結合的方式處理連續(xù)3 a 種植草莓的土壤，一方面探索連作土壤在敵磺鈉處理前后的微生物區(qū)系變化，另一方面研究分析不同肥料在調節(jié)土壤微生物區(qū)系上的差異，從而更加全面地了解殺菌劑和微生物菌肥對土壤的作用，旨在為科學種植草莓提供全面詳細的科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試草莓品種為紅顏；化肥為史丹利復合肥；有機肥料為雞糞堆肥，購自平遙縣潤生態(tài)肥業(yè)有限公司；綠隴復合微生物菌劑，購自山東綠隴生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 對連作土壤進行消毒處理 田間試驗在榆次市東陽鎮(zhèn)試驗基地進行，試驗地土壤為連作3 a種植草莓的土壤。將上茬草莓植株清理干凈，用旋耕機進行土壤旋耕，深度達到30～40 cm，均勻噴灑敵磺鈉溶液（70%可溶性粉劑15.00～18.75 kg/hm2，溶于100～150 kg 水中），處理3 d 后進行分析。

對消毒前后的土壤進行取樣并分析，土樣編號消毒前為A，消毒后為B。各個土壤處理采取5 點取樣法，并充分混勻，用于土壤微生物分析。

測試土壤的成分為：總氮含量1.95 g/kg，有效氮22.36 mg/kg，有效磷16.85 mg/kg，有效鉀232 mg/kg，pH 值6.8。

1.2.2 對連作土壤進行施肥處理 在消毒后的土壤上進行化肥、有機肥和微生物菌肥對草莓根際微生物多樣性的研究，試驗設3 個施肥處理，即處理1.底施傳統(tǒng)化學肥料（復合肥750 kg/hm2，過磷酸鈣600 kg/hm2）（CK）；處理2.底施普通有機肥（3 000 kg/hm2）（OF）；處理3.底施微生物菌肥和有機肥（將綠隴復合微生物菌劑（有效活菌數≥200 億個/g，用量7.5 kg/hm2）與有機肥混合，3 000 kg/hm2）（MF）。每個處理3 個重復，共9 個小區(qū)（15.0 m×4.5 m）。

草莓種植壟壟寬為0.45 m，間距為1.0 m，草莓分2 排種植于壟上，2 排間距為25 cm，每排的株間距為15 cm。在草莓生長期可追肥1～2 次，每次施肥75～120 kg/hm2。

1.3 樣品采集

在草莓進入盛花期時采集土壤樣品。采樣時將草莓植株從土壤中整體挖出，將與根系緊密結合的土壤小心刷下來作為根際土壤樣品。每個小區(qū)按照對角線5 點取樣，每點取樣3 株，然后將15 株草莓的根際土壤混合成為1 個土壤樣品。

1.4 生物信息學分析方法

將土樣充分混勻后，送至上海派森諾生物科技有限公司完成真菌和細菌的高通量測序和分析。

1.4.1 Alpha 多樣性分析 使用QIIME 軟件分別計算每個樣本的豐富度指數和多樣性指數，其中，群落豐富度用Chao1 指數描述，其可以估計群落中實際存在的物種數，數值越高表明群落物種的豐富度越高；物種多樣性用Shannon 指數描述，其可以反映樣品的多樣性程度，數值越高表明群落物種（程度）種類越豐富。

1.4.2 分類學組成分析 根據OUT 矩陣數據，使用QIIME 軟件，獲取各樣本在門和屬2 個分類水平上的組成和豐度分布表，比較不同樣品的群落組成，分析樣品間的差異。

2 結果與分析

2.1 草莓根際土壤Alpha 多樣性分析

2.1.1 細菌Alpha 多樣性分析 比較樣品A（未處理土壤）和B（敵磺鈉處理后土壤）的指數發(fā)現(xiàn)，敵磺鈉處理后土壤細菌的Chao1 指數要高于未處理的連作土壤，而Shannon 指數則是敵磺鈉處理后土壤低于未處理的連作土壤。說明敵磺鈉消毒后的土壤細菌的物種數升高，而細菌多樣性降低了（表1）。

表1 不同處理土壤群落豐富度和多樣性指數

綜合分析表1 中的3 個處理組的細菌多樣性指數發(fā)現(xiàn)，細菌物種數目的改變和多樣性的變化正好相反，Chao1 指數由高到低排列順序為CK＞OF＞MF；Shannon 指數由高到低排列順序為MF＞OF＞CK。種植草莓后，其根際土壤的細菌豐富度都有所升高，對照組的指數是最高的，說明作物對于土壤細菌物種數的增加起重要作用；有機肥對于物種數的增加效果要好于微生物菌肥，這可能是因為后者自身細菌的影響。與對照組相比，有機肥和微生物菌肥都提高了細菌多樣性，尤其是微生物菌肥對細菌多樣性的提高更加明顯。

2.1.2 真菌Alpha 多樣性分析 由表1 可知，樣品A 真菌的Chao1 指數和Shannon 指數極高，說明連作土壤中真菌種類豐富、多樣性極高；而B 的2 個指數都很低，證明敵磺鈉對土壤中真菌的殺菌效果十分明顯。

分析B 和3 個處理組的Chao1 指數發(fā)現(xiàn)，CK、OF 和MF 的物種數相差不多，但是較B 均得到了提高，分別提高了2.74 倍、2.67 倍和2.81 倍；與A的差距仍然十分明顯，都不足A 的1/3。說明草莓的種植增加了土壤中的真菌物種數，3 個處理組的物種數相差不多，而施肥方式并沒有明顯影響土壤中真菌的物種數。

分析B 和3 個處理組的Shannon 指數發(fā)現(xiàn)，CK、OF 和MF 的指數要高出B 很多，說明草莓的種植明顯改善了敵磺鈉處理后土壤的真菌多樣性。同時發(fā)現(xiàn)，CK 的指數與A 較為接近，而OF 和MF 則與A 相差較大，這充分說明化肥對于土壤真菌多樣性的調節(jié)作用有限，遠遠低于有機肥和微生物菌肥對于土壤真菌多樣性的影響。

2.2 群落門分類水平組成分析

2.2.1 細菌群落門水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的細菌（豐度值大于1%）主要來自于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、[thermi]門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、od1 門和藍藻門（Cyanobacteria）。

從圖1 可以看出，B 的變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和[thermi]門的豐度值明顯要高于A，尤其是擬桿菌門，豐度值的增加十分明顯；其余門的豐度值均下降。說明敵磺鈉可以改變土壤中某些細菌群落在門水平上的相對豐度值。

分析3 個處理組，結果發(fā)現(xiàn)（圖2），變形菌門和放線菌門是每個處理的優(yōu)勢細菌門；MF 的變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、[thermi]門和藍藻門的豐度值是最高的；OF 的浮霉菌門、擬桿菌門和od1 門最高；芽單胞菌門和疣微菌門則在CK 中最高。微生物菌肥施用后，土壤中門水平上豐度值最高的細菌門最多，有機肥次之，而對照組最少。說明在改變細菌群落上的作用方面，微生物菌肥的作用要大于有機肥的作用。

2.2.2 真菌群落門水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的真菌主要來自6 個門（圖3，4），包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）和壺菌門（Chytridiomycot）。其中，子囊菌門是5 個處理中豐度值占絕對優(yōu)勢的真菌門，在B 中的豐度值達到了99.21%，高于A；在OF 中的豐度值要高于其他2 個施肥處理組。

除了子囊菌門之外，敵磺鈉處理對其他門水平上的真菌豐度值影響很大，有3 個門的豐度值都降為0，說明敵磺鈉殺真菌的效果比較顯著，而且很有針對性；隨著草莓的種植以及肥料的施用，真菌的種類及豐度值均有所恢復，但是無論是何種施肥方式處理，子囊菌門仍然保持其主要地位。

2.3 群落屬分類水平組成分析

2.3.1 細菌屬分類水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的豐度值為0.5%的有15 個屬（圖3），其中，變形菌門有4 個屬，放線菌門有5 個屬，浮霉菌門有1 個屬，綠彎菌門有2個屬，厚壁菌門有1 個屬，[thermi]門有1 個屬，疣微菌門有1 個屬。

由圖5 可知，經過敵磺鈉處理后，土壤中的假單胞菌屬（Pseudomonas）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、海 桿 菌 屬（Marinobacter）、溶 桿 菌 屬（Lysobacter）、犁頭霉屬（Planctomyces）、馬拉杜拉放線菌屬（Actinomadura）和B-42 屬的豐度值升高，其余屬的豐度值均降低，另外，Methylocaldum 和席藻（Phormidium）的豐度值變成0。

從圖6 可以看出，MF 的假單胞菌屬、藤黃單胞菌屬、溶桿菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）、綠線菌屬（Chloronema）、芽孢桿菌（Bacillus）和B-42 屬的豐度值均高于其余2 個處理組，其中，假單胞菌屬、鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬的細菌多為生物防治中使用的益生菌，說明微生物菌肥的使用提高了土壤中傳統(tǒng)益生菌的比例。

2.3.2 真菌群落在屬水平上的豐度變化 5 個土壤樣品中檢測出的總豐度值在0.5%以上的屬共有5個（圖7，8），其中，子囊菌門有4 個屬，擔子菌門有1 個屬；總豐度值在1%以上的只有足孢子菌屬（Podospora）和嗜熱真菌（Mycothermus）。

從圖7 可以看出，B 的豐度值均低于A，足孢子菌屬的豐度值降低為0，說明敵磺鈉對于真菌屬水平的影響較大；而由圖8 可知，足孢子菌屬在MF中豐度值最高，CK 中最低，其余屬在3 個處理組中差異很小，施肥處理對真菌群落在屬水平上的變化存在一定影響。

3 結論與討論

健康土壤中的微生物群落結構處于一種良好的平衡狀態(tài)，單一作物的連續(xù)種植導致土壤結構發(fā)生改變，進而導致土壤中微生物群落發(fā)生變化，有益微生物處于劣勢，而有害微生物則占據了優(yōu)勢，尤其是土壤中病原真菌的比例會大大增加[12]。

3.1 敵磺鈉對于土壤微生物多樣性的影響

敵磺鈉是一種常用的土壤土傳病害的殺菌劑[21-22]，本研究結果表明，敵磺鈉對于土壤真菌的多樣性影響要遠遠大于對于細菌多樣性的影響。從多樣性指數分析，經過敵磺鈉處理后的草莓連作土壤，真菌的Shannon 指數和Chao1 指數都顯著降低。這與張慶華等[15]施用棉隆消毒后土壤真菌群落豐度及其生物多樣性均下降的研究結果相似。敵磺鈉對于細菌多樣性的影響結果表明，處理后細菌的Shannon 指數降低，而Chao1 指數反而上升。伍朝榮等[23]研究表明，在厭氧消毒法處理土壤后，其細菌的Chao1 指數反而升高，而Shannon 指數略有降低，其結果與本研究相類似。

敵磺鈉對細菌在門分類水平上的組成沒有顯著影響，在豐度值上有一定改變，而且變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和[thermi]門在敵磺鈉處理之后豐度值升高。敵磺鈉對于真菌群落在門分類水平組成的影響很大，敵磺鈉處理之后土壤中真菌門有3 個豐度值為0，子囊菌門的相對豐度值還大大增加，占到了99.20%。這與張慶華[15]的試驗結果一致，棉隆處理后，只有子囊菌門的豐度值增加，但是并沒有增加很多，由40.91%增加至57.25%。土壤經過處理之后，真菌的種類和多樣性都大大降低。

在屬水平上，敵磺鈉處理后，有2 個細菌屬的豐度值為0，有7 個屬的豐度值升高；僅有1 個真菌屬的豐度值成為0，沒有屬的豐度值升高。在殺菌能力上，敵磺鈉對于真菌具有很強的針對性。

綜上所述，敵磺納處理后，土壤微生物多樣性發(fā)生了極大的改變，幾乎處于一種類似“真空”的狀態(tài)[15]，可以說達到了處理土壤的目的。但是這樣的土壤并不適合進行植株的種植，還需要通過一些方法調節(jié)土壤的微生物群落才可以達到農業(yè)生產的要求。

3.2 不同施肥方式對土壤微生物的影響

土壤進行消毒處理之后，需要對土壤進行恢復性調節(jié)，本試驗采用了有機肥和微生物肥2 種施肥方式進行土壤微生物調節(jié)。

研究表明，不同類型外源有機物的投入對土壤微生物種群數量及其群落結構的影響存在著顯著性差異[24-26]。施用有機肥或者微生物有機肥不僅可以增進土壤肥力，而且能改善作物根系微生態(tài)環(huán)境中的理化性狀，從而提高有益微生物活性及作物的抗病能力[27]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，有機肥和微生物菌肥的施用提高了細菌的多樣性，降低了真菌的多樣性，符合健康的“細菌型”土壤的標準。說明有機肥和微生物肥都能夠有效地改良土壤環(huán)境。這與很多研究結果一致，付琳[28]在試驗中發(fā)現(xiàn)，微生物肥改變了香蕉根際土壤細菌和真菌的群落組成，降低了根際土壤中真菌的豐度并增加了細菌的豐度和多樣性。朱菲瑩等[29]研究表明，棉?。镉袡C肥的處理組中土壤細菌多樣性最高，而且芽孢桿菌屬Bacillus 的豐度值也是最高的，對西瓜枯萎病防治效果最好。

在門水平組成分類上，草莓根際土壤的優(yōu)勢細菌門為變形菌門和放線菌門，而子囊菌門則是真菌中的優(yōu)勢門，豐度值占絕對比例。微生物肥處理組有6 個細菌門（變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、[thermi]門和藍藻門）的豐度值最高；有機肥處理組有4 個細菌門（浮霉菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和od1 門）最高；對照組只有2 個細菌門（芽單胞菌門和疣微菌門）的豐度值最高。真菌門水平則因為子囊菌門的絕對優(yōu)勢，導致其他的真菌門豐度值都很低。肥料的施用對于細菌門水平的影響要大于真菌門水平的影響，而微生物菌肥的影響又大于有機肥的影響。

在細菌的屬水平上，微生物肥處理后，有7 個屬的細菌豐度值要高于有機肥組和對照組，其中包括假單胞菌屬、鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬，而這3 個屬的細菌大多是有益菌。付琳等[28]研究也證實，微生物肥的加入提高了根際細菌群落的豐富度和多樣性，并誘導了巨大芽孢桿菌、熒光假單胞菌和放線菌的富集。朱菲瑩等[29]研究證實，在棉?。镉袡C肥的處理組中，土壤細菌多樣性最高，而且芽孢桿菌屬的豐度值也是最高的，對西瓜枯萎病防治效果最好。可以說微生物肥的加入使得土壤中有益細菌的豐度值增加，更容易發(fā)揮生物防治的效果，比起其他2 種肥料來說，改良土壤環(huán)境的能力更強。與此相反，真菌群落在屬水平上的變化并不明顯，其中，足孢子菌屬在微生物肥處理后豐度值最高，其余的4 個屬均是對照組的豐度值最高。

3.3 連作土壤處理的最佳組合

本研究針對草莓連作土壤的處理分為2 步，首先采取化學手段進行土壤殺菌，草莓土傳病害主要是真菌性病害[30]，所以敵磺鈉的施用對于真菌有效果良好；其次采用有機肥和微生物肥料進行土壤微生物以及根際土壤群落結構的調節(jié)，結果發(fā)現(xiàn)，效果最好的是微生物肥，經過處理后土壤的真菌多樣性降低，細菌的多樣性提高，同時，有益菌包括假單胞菌屬[31]、鏈霉菌屬[32-33]和芽孢桿菌屬[34]在草莓的根際成功定殖，將連作土壤恢復成適合草莓植株生長的土壤環(huán)境。張慶華等[15]研究認為，采用棉隆和添加生物菌肥相結合的方式可為草莓根際微生物（真菌群落）提供更有利的生長環(huán)境，也為土傳病害的有效防治和生物菌肥高效利用提供理論依據，其研究結論與本研究基本一致。朱菲瑩等[29]研究也認為，棉隆對土壤熏蒸消毒的作用加上生物有機肥施用后對土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建（尤其是細菌群落結構），有利于西瓜植株的健康生長。

連作土壤的處理是一個需要結合多種手段的綜合治理過程，目前使用較多的方法就是先治再調，也取得了一定的效果，微生物群落多樣性的分析有助于了解土壤在受到外界干擾時內部的結構變化，幫助我們了解處理手段的優(yōu)劣，從而找到合適的處理手段。但是，土壤環(huán)境的復雜性決定了其受多種因素所調節(jié)[35]，所以，還需要進行很多更加深入透徹的研究，才能為綜合治理提供科學依據。