葉樺珍，陳國(guó)南

(1. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建 福州 350101； 2. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

0 引言

N6-異戊烯基腺嘌呤 (N6-isopentenyl adenine，iP)用于調(diào)節(jié)農(nóng)作物的生長(zhǎng), 是植物體內(nèi)發(fā)揮主要功效的腺嘌呤型細(xì)胞分裂素之一[1]. 細(xì)胞分裂素結(jié)合蛋白已從多種植物中分離得到，它們可能在細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 體內(nèi)運(yùn)輸及代謝中起作用[2-3]. 近年來一些腺嘌呤型細(xì)胞分裂素及其衍生物被發(fā)現(xiàn)具有抗衰老及抗氧化等作用[3-4]，在化妝品和分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景. 因而研究腺嘌呤型細(xì)胞分裂素與蛋白質(zhì)的相互作用，有助于相關(guān)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究，對(duì)于細(xì)胞分裂素分子作用機(jī)理的研究也具有一定的參考意義.

熒光光譜法是研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用最有利的手段之一. 本研究發(fā)現(xiàn)，N6-異戊烯基腺嘌呤本身無熒光，但在pH=7.4的緩沖溶液中可明顯猝滅牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的內(nèi)源性熒光. 基于這一猝滅現(xiàn)象，研究不同濃度的iP對(duì)BSA熒光光譜的影響，可獲得iP對(duì)BSA熒光的猝滅類型、iP對(duì)BSA構(gòu)象的影響、 二者間作用力類型、 表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等諸多相互作用信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Lambda 750型紫外可見分光光度計(jì) (美國(guó)Perkin Elmer公司)； CARY Eclipse型熒光分光光度計(jì) (美國(guó)Varian公司)； N6-異戊烯基腺嘌呤(iP)(AR，美國(guó)Sigma公司)； 牛血清白蛋白(BSA)(BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 三羥甲基氨基甲烷(Tris)(GR, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為新制超純化水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

熒光分光光度計(jì)掃描時(shí)激發(fā)光單色器與發(fā)射光單色器的狹縫均設(shè)為5 nm, 光電倍增管電壓設(shè)為medium，掃描速率為600 nm·min-1； 紫外可見分光光度計(jì)狹縫寬度設(shè)為2 nm.

iP標(biāo)準(zhǔn)溶液與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液制備時(shí)分別以0.1 mol·L-1NaOH和二次蒸餾水為溶劑； 0.05 mol·L-1Tris-HCl-NaCl緩沖溶液中含有0.05 mol·L-1NaCl, 以濃HCl調(diào)節(jié)pH值為7.4.

按所需濃度移取一定量的iP標(biāo)準(zhǔn)溶液及BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，以Tris-HCl-NaCl緩沖溶液定容得到測(cè)試用的混合溶液，于室溫或置電熱恒溫水槽中放置30 min后，測(cè)定混合溶液的熒光激發(fā)光譜、 熒光發(fā)射光譜、 熒光同步掃描圖譜及紫外可見吸收光譜. 以281 nm作為熒光激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)得BSA在最大發(fā)射波長(zhǎng)347 nm處的熒光強(qiáng)度記為F0，BSA與iP混合溶液在347 nm處的熒光強(qiáng)度記為F，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖譜的變化情況進(jìn)行相互作用分析[5].

2 結(jié)果與討論

2.1 iP對(duì)BSA熒光光譜的影響

圖1 iP與BSA混合溶液體系的發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectra of the mixed solution system of iP and BSA

iP本身無熒光，而BSA有明顯的內(nèi)源熒光. 以BSA的最大激發(fā)波長(zhǎng)281 nm作為熒光體系的激發(fā)波長(zhǎng)，在室溫下測(cè)定不同濃度的iP與10 μmol·L-1BSA混合溶液體系的熒光發(fā)射光譜，測(cè)定結(jié)果如圖1所示. 結(jié)果表明，混合溶液體系的熒光強(qiáng)度隨著iP濃度的升高明顯降低，但光譜的峰形及最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生顯著改變，說明iP對(duì)BSA的熒光產(chǎn)生猝滅，兩者之間發(fā)生了相互作用現(xiàn)象.

2.2 熒光猝滅類型的確定

熒光物質(zhì)與猝滅劑之間可發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅、 靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)與靜態(tài)聯(lián)合猝滅的作用. 若熒光猝滅基于猝滅劑和激發(fā)態(tài)熒光分子間發(fā)生了有效碰撞和電荷轉(zhuǎn)移而發(fā)生，猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而增大，稱為動(dòng)態(tài)猝滅； 若熒光猝滅基于猝滅劑和處于基態(tài)的熒光物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成不發(fā)光的復(fù)合物而使KSV隨溫度的升高而降低，則稱為靜態(tài)猝滅[6]. 研究猝滅類型有助于揭示猝滅劑和熒光物質(zhì)間的作用機(jī)制. 本研究采用Stern-Volmer方程法和紫外可見吸收光譜法研究iP對(duì)BSA熒光的猝滅類型.

假設(shè)iP與BSA之間形成1∶1型的復(fù)合物，BSA的熒光強(qiáng)度F0與加入iP后BSA體系的熒光強(qiáng)度F的比值符合Stern-Volmer方程式[6]:F0/F=1+KSV·ciP，其中KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù). 將BSA濃度固定為10 μmol·L-1，分別加入濃度為0、 5、 10、 20、 40、 60 μmol·L-1的iP，測(cè)定在不同反應(yīng)溫度下，混合溶液體系在347 nm處的熒光強(qiáng)度. 以F0/F為縱坐標(biāo)、 iP濃度為橫坐標(biāo)繪制Stern-Volmer曲線，如圖2所示，其相關(guān)方程如表1所示.

由表1和圖2的結(jié)果可知，iP與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線線性關(guān)系較好，隨著溫度的升高，曲線的斜率即猝滅常數(shù)KSV呈降低趨勢(shì). 據(jù)此可推斷iP對(duì)BSA熒光的猝滅類型主要為靜態(tài)猝滅，iP與BSA兩者間形成了基態(tài)復(fù)合物.

靜態(tài)猝滅常常引起熒光物質(zhì)紫外可見吸收光譜的改變. 為驗(yàn)證對(duì)iP與BSA熒光猝滅類型的推斷，在290 K的溫度下，分別測(cè)定10 μmol·L-1BSA溶液 、 25 μmol·L-1iP溶液及兩者混合溶液的紫外可見吸收光譜，并將BSA與iP疊加后的光譜與混合溶液的紫外可見吸收光譜進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見，混合溶液的紫外可見吸收光譜(曲線3)與疊加所得的光譜(曲線4)不重合，且最大吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生了一定程度的紅移. 由此可推斷混合溶液中產(chǎn)生了新的化合物，該結(jié)論與Stern-Volmer方程法得出的iP對(duì)BSA熒光猝滅的類型為靜態(tài)猝滅的推斷一致.

表1 iP與BSA熒光體系在不同溫度下的Stern-Volmer 方程

圖2 iP與BSA熒光體系在不同溫度下的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer plots of iP-BSA fluorescence system at different temperatures

圖3 BSA、 iP及二者混合溶液的紫外可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of BSA, iP and mixed solution of them

2.3 表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

基于BSA與iP形成了基態(tài)復(fù)合物，可由公式lg[(F0-F)/F]= lgKa+nlgciP近似計(jì)算二者的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，其中Ka為表觀結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[7]. 以節(jié)2.2中所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算lg[(F0-F)/F]，并以lgciP為自變量進(jìn)行線性回歸分析, 所得方程及不同溫度下Ka及n的計(jì)算結(jié)果列于表2.

表2 不同溫度下iP與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由表2結(jié)果可知，不同溫度下測(cè)得的iP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均約為1，說明二者的結(jié)合位點(diǎn)只有一個(gè);Ka在290～302 K區(qū)間隨著溫度的升高而降低，原因是iP與BSA反應(yīng)生成的基態(tài)復(fù)合物的穩(wěn)定性會(huì)隨著溫度升高而降低，這一結(jié)果與以上iP對(duì)BSA的猝滅屬于靜態(tài)猝滅的推斷相符合. 但從表2也可看出，溫度為310 K時(shí)，Ka較302 K時(shí)明顯增加，且由圖2可看出310 K相應(yīng)曲線上iP濃度高時(shí)Stern-Volmer曲線向Y軸偏離，這些現(xiàn)象說明在高溫度與高濃度的條件下，由于分子運(yùn)動(dòng)的加劇及有效碰撞的分子數(shù)目增大，動(dòng)態(tài)猝滅概率增加，體系的猝滅類型表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)與靜態(tài)聯(lián)合猝滅而使猝滅效果增強(qiáng). 故測(cè)定蛋白質(zhì)與小分子形成復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)時(shí)，應(yīng)考慮溫度與濃度的影響.

2.4 分子間作用力類型的確定

生物大分子和小分子間存在氫鍵、 靜電引力、 范德華力和疏水力等作用力，分子間作用力類型可通過一些熱力學(xué)參數(shù)的求算來判別. 假設(shè)在290～302 K的溫度范圍內(nèi)，iP與BSA反應(yīng)的焓變?chǔ)無明顯變化可視為常數(shù)，利用Van’t Hoff方程的推導(dǎo)公式lnKa=-ΔH/RT+ ΔS/R，即可求取反應(yīng)體系的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，再利用公式ΔG=-RTlnKa可求取反應(yīng)體系的自由能變化ΔG[8]. 其中T為開爾文溫度，氣體常數(shù)R值為8.314，計(jì)算結(jié)果列于表3. 對(duì)于小分子和蛋白質(zhì)結(jié)合體系，如果求得的熱力學(xué)參數(shù)ΔH<0且ΔS<0，則兩者之間的作用力主要為氫鍵或范德華力; 若ΔH<0且ΔS>0，則兩者之間的作用力主要為靜電引力； 若ΔS>0且ΔH>0，則兩者之間作用力主要為疏水力； 若ΔG<0，說明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的[9]. 由表3數(shù)據(jù)結(jié)合以上判據(jù)可知，iP與BSA之間的作用力主要為氫鍵或范德華力，兩者的反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的.

表3 iP與BSA相互作用體系的熱力學(xué)常數(shù)

2.5 iP對(duì)BSA構(gòu)象的影響

熒光同步掃描技術(shù)常用于研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用. 對(duì)于BSA的同步掃描熒光光譜，波長(zhǎng)差Δλ為60 nm和15 nm時(shí)掃描獲得的熒光同步掃描光譜分別顯示色氨酸殘基和酪氨酸殘基的光譜特征，熒光同步掃描光譜藍(lán)移表明氨基酸所處環(huán)境的疏水性增加，紅移則表明極性增加[7].

室溫下, 分別測(cè)定在10 μmol·L-1BSA中加入不同濃度iP后，Δλ為60 nm和15 nm時(shí)的同步掃描熒光譜圖，結(jié)果如圖4所示. 圖4(a)、 (b)的同步掃描熒光圖譜均顯示，隨著iP濃度升高，熒光強(qiáng)度下降且峰位紅移. 由此可以推斷iP與BSA的結(jié)合改變了BSA的構(gòu)象以及色氨酸與酪氨酸殘基所處的環(huán)境，使這兩個(gè)可發(fā)熒光的基團(tuán)所處環(huán)境的極性增大.

圖4 iP與BSA混合溶液體系的同步掃描熒光光譜Fig.4 Synchronous scanning fluorescence spectra of mixed solution system of iP and BSA

有研究表明，芳香族小分子與血清白蛋白的結(jié)合位置一般在亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA處[7]，而BSA分子中的兩個(gè)色氨酸殘基分別位于IIA的212位和亞結(jié)構(gòu)域IB的134位[10-11]. 由節(jié)2.3結(jié)果可知，iP與BSA的結(jié)合部位僅有一個(gè)，故可進(jìn)一步推斷該結(jié)合部位靠近IIA亞結(jié)構(gòu)域212位上的色氨酸, iP與BSA的結(jié)合微擾了IIA亞結(jié)構(gòu)域疏水腔結(jié)構(gòu)，致色氨酸殘基所處環(huán)境的極性增加, 相應(yīng)的熒光減弱.

3 結(jié)語

本研究應(yīng)用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法考察了N6-異戊烯基腺嘌呤與牛血清白蛋白的相互作用. 確定了在低溫時(shí)二者通過氫鍵或范德華力結(jié)合生成1∶1的基態(tài)復(fù)合物，熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，結(jié)合部位靠近BSA的IIA亞結(jié)構(gòu)域上的112位色氨酸. 該研究對(duì)于揭示腺嘌呤型細(xì)胞分裂素分子作用機(jī)理和進(jìn)行相關(guān)藥物的研發(fā)具有一定的參考意義.