劉榮華 ，何文容

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期婦女中最常見的內(nèi)分泌疾病，主要臨床特征是月經(jīng)不調(diào)、雄激素過多癥、不孕癥和代謝異常的無排卵［1-2］。研究表明，PCOS的發(fā)病與遺傳、環(huán)境和飲食生活習慣等有關(guān)，且多種基因參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展［3］，但目前尚無特效治療方法。Patel等［4］于2008年從健康女性經(jīng)血中分離出一種間充質(zhì)干細胞，將其命名為經(jīng)血源干細胞（Men-strual derived stem cells，MenSCs），其具有多向分化潛能及細胞因子分泌功能，能夠有效修復受損組織，促進組織再生。隨著干細胞研究及應用的迅速發(fā)展，干細胞移植被用于心肌梗死［5］、帕金森?。?］、腦缺血性損傷［7］等疾病治療也已取得初步療效，這也為PCOS的治療提供了新的思路。目前，有關(guān)PCOS的干細胞治療研究較少，既有文獻多為脂肪干細胞治療，但效果有限［8］。因此，本實驗通過構(gòu)建PCOS動物模型，探討MenSCs移植對大鼠PCOS的影響及潛在的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 8周齡雌性健康成年SD大鼠45只，體質(zhì)量180～210 g，購自湖北省實驗動物中心，動物飼料購自上海普路騰生物科技有限公司。脫氫表雄酮（DHEA）購自上海麥克林生化科技有限公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）均購自天根生化科技（北京）有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。Bax多克隆抗體購自美國Sigma公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國R&D公司。形態(tài)學觀察采用Olympus BX51顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 MenSCs細胞株由亞洲干細胞庫贈與，細胞置于37℃、濃度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM，細胞融合至80%左右傳代，制備細胞懸液。

1.2.2 動物模型 所有大鼠均自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度（60±5）%，光照時間8 h，5只一籠，籠底墊輻照墊料。適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組：對照組15只，不做干預處理，飼養(yǎng)5周；PCOS組15只，肌內(nèi)注射DHEA，注射劑量為60 mg/kg，連續(xù)注射20 d，飼養(yǎng)5周［9］。移植組15只，肌內(nèi)注射DHEA，注射劑量為60 mg/kg，連續(xù)注射20 d，飼養(yǎng)3周后，經(jīng)尾靜脈注射MenSCs懸液200 μL（5.0×107個/mL），注射后再繼續(xù)飼養(yǎng)2周［10］。

1.2.3 血清學檢查 3組大鼠于第5周末通過眼眶靜脈叢取血，每只大鼠收集約0.5 mL，ELISA試劑盒檢測促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinising hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progesterone，P）、睪酮（testosterone，T）、泌乳素（prolactinemia，PRL）。

1.2.4 卵巢形態(tài)學觀察 各組大鼠于第5周末全部處死后取出卵巢組織，用預冷的生理鹽水洗滌。組織在10%福爾馬林中固定24 h，梯度乙醇脫水并包埋在石蠟中。將組織切成6個固定切片（5μm），用蘇木精和伊紅染色。通過顯微鏡（×200）觀察卵巢形態(tài)學改變并拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miRNA-135表達 用Trizol裂解細胞提取卵巢組織總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應體系為20μL，根據(jù)試劑盒說明書將miRcute Plus miRNA PreMix（10 μL）、ROX Reference Dye（1.6 μL）、上下游引物各0.4μL，cDNA和ddH2O加入體系反應。miRNA-135引物序列：上游5′-UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG-3′，下游 5′-AACAUAGGAAUAAAAAGCCAUAUU-3′；內(nèi)參為 U6，上 游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反應條件：預變性95℃3 min；變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 10 s、延伸70 ℃ 10 s，擴增40個循環(huán)；65～95℃，每0.5℃5 s梯度遞增；終止反應。實時熒光定量系統(tǒng)為Applied Biosystems?7300，數(shù)據(jù)采用Step One 2.3分析。

1.2.6 蛋白表達檢測 用RIPA裂解液提取卵巢組織中的總蛋白。BCA試劑盒定量檢測蛋白質(zhì)濃度。5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；將膜與Bax多克隆兔抗體（1∶800稀釋），4℃溫育12 h，與辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育1 h（1∶6 000）。電化學發(fā)光試劑盒檢測信號，凝膠成像儀采集圖像，使用Quantity One 4.6分析軟件定量蛋白質(zhì)條帶強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Bonferroni-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清學檢查結(jié)果比較 3組大鼠E2、P及PRL差異無統(tǒng)計學意義。與對照組比較，PCOS組FSH水平降低，而LH和T水平升高（P＜0.05），其他指標差異無統(tǒng)計學意義；移植組與對照組各指標差異均無統(tǒng)計學意義。與PCOS組比較，移植組FSH水平升高，而LH和T水平降低（P＜0.05），其他指標差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 卵巢形態(tài)觀察 對照組卵泡形態(tài)正常，PCOS組卵巢可見到較多囊狀擴張的卵泡，移植組多囊狀擴張的卵泡較PCOS組減少，見圖1。

2.3 各組卵巢組織中miRNA-135、Bax和Bcl-2的表達水平比較 與對照組比較，PCOS組miRNA-135和Bcl-2蛋白相對表達水平降低，而Bax蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，移植組miRNA-135和Bcl-2蛋白相對表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低（P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.1 Comparison of the metabolic and hormonal indicators between three groups表1 3組大鼠代謝和激素指標比較 （n=15，±s）

Tab.1 Comparison of the metabolic and hormonal indicators between three groups表1 3組大鼠代謝和激素指標比較 （n=15，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與PCOS組相比，P＜0.05

組別對照組PCOS組移植組F FSH（mU/ml）15.25±4.56 8.54±5.50a 12.67±4.32b 7.396＊＊LH（nmol/L）10.65±2.66 19.28±3.85a 15.42±3.21b 26.120＊＊E2（nmol/L）0.24±0.06 0.22±0.05 0.20±0.04 2.338 P（nmol/L）25.65±6.58 23.55±8.23 26.68±9.10 0.591 T（nmol/L）1.25±0.22 1.64±0.48a 1.45±0.32b 4.490＊PRL（nmol/L）0.48±0.12 0.51±0.18 0.46±0.17 0.377

Fig.1 Comparison of the ovarian morphological changes between three groups（HE staining,×200）圖1 各組大鼠卵巢形態(tài)變化對比（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of the expressions of miRNA-135,Bax and Bcl-2 proteins between three groups表2 各組卵巢組織miRNA-135、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的相對表達水平比較 （n=15，±s）

Tab.2 Comparison of the expressions of miRNA-135,Bax and Bcl-2 proteins between three groups表2 各組卵巢組織miRNA-135、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的相對表達水平比較 （n=15，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與PCOS組相比，P＜0.05

組別對照組PCOS組移植組F miRNA-135 1.03±0.03 0.43±0.16a 0.77±0.12b 99.610＊＊Bax蛋白1.05±0.04 1.87±0.39a 1.65±0.56b 17.430＊＊Bcl-2蛋白1.02±0.03 0.77±0.29a 0.85±0.26b 4.807＊

Fig.2 The protein expressions of Bax and Bcl-2 in ovarian in three groups圖2 3組大鼠卵巢組織中Bax和Bcl-2的表達

3 討論

PCOS是一種多因素共同作用、多基因參與的疾病。目前，PCOS常用的治療藥物有氯米芬、絨促性素、糖皮質(zhì)激素和尿促性素等，手術(shù)治療為雙側(cè)卵巢楔形切除術(shù)，藥物和手術(shù)治療均有一定的風險［11］。隨著干細胞研究的不斷深入，用干細胞來治療許多難以治愈的疾病已成為可能。目前，有關(guān)PCOS的干細胞治療研究較少，有報道脂肪干細胞治療對于PCOS有治療效果，但存在一定局限［8］。近年來，通過刮宮、手術(shù)等方式獲取子宮內(nèi)膜干細胞的創(chuàng)傷性方法已經(jīng)逐步被無創(chuàng)性方法取代，女性經(jīng)血也可以獲取子宮內(nèi)膜干細胞。MenSCs與其他類型的間充質(zhì)干細胞相比，具有取材無創(chuàng)傷性、細胞增殖速度快和低免疫原性等優(yōu)點，這使異體移植成為可能。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過MenSCs注射以后，移植組FSH、LH、T水平較PCOS組均有明顯的改善，且移植組多囊狀擴張的卵泡較PCOS組減少，表明干細胞移植對于PCOS有較明顯的治療效果。

干細胞移植到體內(nèi)以后，通過“歸巢”（Homing）方式對損傷組織進行修復［12］。干細胞歸巢是細胞遷移到并植入其可以發(fā)揮局部功能效應的組織的過程。干細胞具有優(yōu)先“歸巢”到損傷與炎癥部位的特點，并可促進組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復［12］。研究表明，歸巢是由流動細胞和靶組織處的血管內(nèi)皮之間的抗剪切黏合劑相互作用引發(fā)的級聯(lián)事件。該過程由“歸巢受體”介導，“歸巢受體”與相關(guān)的內(nèi)皮共受體結(jié)合，可導致內(nèi)皮表面上的細胞束縛和滾動接觸，隨后是趨化因子觸發(fā)的整聯(lián)蛋白黏附性和外滲的活化［13］。另有研究認為，無論組織如何，干細胞都可選擇性地歸巢于損傷部位［14］。

研究顯示，在PCOS患者的卵泡液及顆粒細胞中miRNA-135表達量較正常人明顯增加，而miRNA-135具有抑制凋亡基因Bax表達的功能［15］。本研究結(jié)果顯示，PCOS組較對照組miRNA-135的表達降低，而移植組較PCOS組的表達升高，表明MenSCs注射抑制了miRNA-135降低。Bax基因是Bcl-2基因家族的一員。Bax基因編碼Bax蛋白，Bax蛋白通過激活線粒體電壓依賴陰離子通道（voltagedependent anion channel，VDAC）并與之相互作用，可導致細胞膜電位下降并釋放細胞色素C。Bax蛋白還可與Bcl-2家族其他蛋白形成二聚體，促進細胞凋亡。相關(guān)研究表明，Bax和Bcl-2信號傳導途徑與PCOS大鼠顆粒細胞的凋亡密切相關(guān)［16］。在這些靶標中，Bcl家族成員被認為是細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子，最具特色的成員是Bcl-2和Bax。Bax蛋白作為Bcl-2的拮抗劑，是Bcl-2的相關(guān)蛋白同源物。通過Bax蛋白促進細胞凋亡的途徑可能與抗凋亡蛋白Bcl-2有關(guān)［16-17］。相關(guān)研究表明，Bax在組織和器官中的表達比Bcl-2更廣泛，并且它也在雄性睪丸和雌性卵巢中表達［17］。本研究結(jié)果顯示，PCOS組較對照組卵巢組織Bax蛋白過量表達，Bcl-2蛋白表達降低；而移植組較PCOS組Bax蛋白過量降低，Bcl-2蛋白表達過量，表明干細胞移植降低了Bax的表達，升高了Bcl-2表達，提示Bax和Bcl-2途徑可能在干細胞修復PCOS損傷中起了重要作用。

綜上所述，MenSCs是一種在臨床治療和修復上有意義的效應細胞，有望被廣泛地應用于治療領(lǐng)域。