王健 林貴斌 曹佳淋

【摘要】 目的：觀察苦參堿對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的體外增值情況，探索潛在的分子機(jī)制。方法：顯微鏡下查看苦參堿對(duì)K562細(xì)胞的影響，聯(lián)苯胺染色測(cè)定K562細(xì)胞的分化趨向，采用MTT法測(cè)定K562細(xì)胞在用藥后的增殖抑制效應(yīng)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)以及雙標(biāo)記法測(cè)定K562細(xì)胞的周期變化和凋亡作用。結(jié)果：相較于陰性對(duì)照組，當(dāng)苦參堿為0.05、0.10和0.20 mg/mL，K562細(xì)胞均呈現(xiàn)紅系分化趨勢(shì)，以0.05 mg/mL最為突出。MTT結(jié)果表明0.2、0.5和1.0 mg/mL對(duì)K562細(xì)胞表現(xiàn)出的生長(zhǎng)抑制率依次為26.15%、45.90%和63.52%（P<0.01），有效濃度0.6 mg/mL。苦參堿能夠?qū)562細(xì)胞定格于S期，抑制有絲分裂，誘導(dǎo)K562細(xì)胞快速地凋亡，0.2、0.5和1.0 mg/mL，對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率依次為5.30%、62.13%與56.73%，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的1.67%（P<0.01）。結(jié)論：針對(duì)體外增殖的人慢粒K562細(xì)胞，苦參堿有明顯的抑制效果，可誘導(dǎo)細(xì)胞紅系分化，促進(jìn)早期凋亡。

【關(guān)鍵詞】 苦參堿; 慢性粒細(xì)胞白血病; K562細(xì)胞; 細(xì)胞分化; 細(xì)胞凋亡

【Abstract】 Objective：To observe the effect of matrine on human chronic leukemic cell lines K562 in vitro，and to explore the possible mechanism.Method：Morphological changes of K562 cells were observed by light microscopy.The tendency of K562 cells towards erythroid differentiation was detected by benzidine staining.The effect of matrine on the proliferation inhibition and the cell cycle of K562 were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.Annexin V-FITC/PI affinity assay was used to detect the apoptosis of K562 cells induced by matrine.Result：Compared to untreated K562 cells，the cells treated with matrine at the concentration of 0.05，0.10 and 0.20 mg/mL all exhibited erythroid differentiation and the effect of 0.05 mg/mL matrine was the most significant.The proliferation inhibitory rates were 26.15%，45.90% and 63.52% by MTT assay after treated with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine，respectively.The median concentration of matrine was 0.6 mg/ml.Matrine can also block K562 cells cycle at the S stage，prevent the cells division from mitosis and induce the cells into apoptosis.About 5.30%，62.13% and 56.73% K562 cells were induced apoptosis with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine treatment by the Annexin V-FITC/PI affinity assay，respectively，with a significant difference compared with the spontaneous apoptosis（1.67%）of the untreated cells（P<0.01）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation of human CML K562 cells in vitro，induce erythroid differentiation and promote early apoptosis.

【Key words】 Matrine; Chronic myelocytic leukemia; K562 cell lines; Differentiation; Apoptosis

First-authors address：The Third Peoples Hospital of Huizhou，Huizhou 516000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.006

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）作為一種血液惡性腫瘤，發(fā)病率較高。我國(guó)青少年中，CML也是最普遍的惡性腫瘤，它呈現(xiàn)高度增生、侵襲性高的生物學(xué)特征，慢粒防治長(zhǎng)期為臨床的重點(diǎn)?？梢?jiàn)，找到新型的治療方法與抗癌藥物，對(duì)慢粒的臨床治療有深遠(yuǎn)的意義[1]?？鄥A（Matrine）最早源于傳統(tǒng)中藥典籍，是從苦參中提取而來(lái)的生物堿成分，有消炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等不同的藥理學(xué)作用[2-3]。近年研究表明，它有顯著的抗腫瘤活性，能夠減少腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖、惡性轉(zhuǎn)移，加速凋亡或使其分化[4]。不過(guò)，苦參堿用于防治慢性白血病的分子機(jī)制尚未明確，需有更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)才能用于臨床。本院選取人慢粒白血病K562細(xì)胞，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)室方法評(píng)價(jià)了苦參堿對(duì)K562細(xì)胞的增殖效果，總結(jié)了潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 苦參堿 分子量248.36，純度99.9%，由陜西省科學(xué)院化學(xué)研究所提供。使用雙蒸水配備10 g/L儲(chǔ)存液，在-20 ℃下進(jìn)行儲(chǔ)存。

1.1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所負(fù)責(zé)提供，在RPMI 1640培養(yǎng)基[10%小牛血清（FCS）+青、鏈霉素（濃度依次為100 U/mL、100 μg/mL）]中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基：GIBCO產(chǎn)品（美）+三蒸水（ddH2O）進(jìn)行配備，0.22 μm濾膜抽濾滅菌，于4 ℃下進(jìn)行存儲(chǔ)。小牛血清（FCS）均由杭州四季青生物研究所提供。溴化-（4，-5二甲基噻唑-2）-2、臺(tái)盼藍(lán)染液均是由美國(guó)Sigma公司提供。Annexin V-FITC Kit，由晶美生物工程公司負(fù)責(zé)供應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)板：Corning公司（美）。CO2培養(yǎng)箱：Heraeus公司（德）;超凈工作臺(tái)：源自蘇州凈化設(shè)備廠;低溫離心機(jī)：Hitachi Himal，LF15型，日本;純水儀：Milli-Q Academic Water Purification Sys（美）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad Model 680型）;流式細(xì)胞儀：Beckon Dickinson公司（美）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 苦參堿前后，觀察倒置光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞自身的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 聯(lián)苯胺染色 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至6×104/mL，摻加6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。實(shí)驗(yàn)組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.05、0.10以及0.20 mg/mL;陰性對(duì)照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)液。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度飽和，5%比例的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3天對(duì)RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行更換，藥物濃度一致。6 d后搜集細(xì)胞來(lái)完成聯(lián)苯胺染色，以200個(gè)細(xì)胞為例，在顯微鏡下觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算出聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性率。

1.2.3 苦參堿對(duì)K562細(xì)胞作用濃度-時(shí)間曲線的測(cè)定 搜集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至1.8×105/mL，摻加到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。實(shí)驗(yàn)組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.2，0.5以及1.0 mg/mL。陰性對(duì)照組：摻入人等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，各種濃度均設(shè)計(jì)6個(gè)平行孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度均飽和，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中開(kāi)始培養(yǎng)。每組選擇1孔，運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法來(lái)對(duì)活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)算，接連6 d，查看不同時(shí)段、各種濃度苦參堿對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的不同影響。

1.2.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 搜集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至6×104/mL，在96孔板中進(jìn)行接種，200 μL/孔。實(shí)驗(yàn)組：將苦參堿藥液摻加到細(xì)胞中，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對(duì)照組：不摻入苦參堿藥液。空白對(duì)照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)基，每個(gè)小組設(shè)計(jì)8個(gè)獨(dú)立的平行孔。在37 ℃下擺放培養(yǎng)板，濕度適中，5%濃度的 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間44 h，對(duì)細(xì)胞上清液150 μL進(jìn)行離心，每孔摻入RPMI 1640 培養(yǎng)基200 μL;5 mg/mL MTT溶液20 μL，接連培養(yǎng)4 h，將上清150 μL予以倒出，摻加二甲基亞砜200 μL，振蕩5 min確保藍(lán)色結(jié)晶可以溶解;充分混勻，利用酶標(biāo)儀來(lái)讀取吸光度值（A570）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A570均值/對(duì)照組A570均值）×100%

1.2.5 細(xì)胞周期分析 搜集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至3.5×105/mL，摻加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。實(shí)驗(yàn)組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對(duì)照組：摻入人等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，各種濃度均設(shè)計(jì)6個(gè)平行孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度均飽和，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中開(kāi)始培養(yǎng)。離心處理后搜集細(xì)胞，使用PBS進(jìn)行洗滌，后用70%冷乙醇加以固定。碘化丙啶（PI）在室溫條件下染色30 min，利用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定細(xì)胞的周期變化和時(shí)相，得到細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 搜集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至3.5×105/mL，在6孔板中進(jìn)行接種，200 μL/孔。實(shí)驗(yàn)組：將苦參堿藥液摻加到細(xì)胞中，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對(duì)照組：不摻入苦參堿藥液;空白對(duì)照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)基。在37 ℃下擺放培養(yǎng)板，濕度適中，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間48 h，離心處理后收集細(xì)胞，將其在緩沖液中進(jìn)行懸浮，F(xiàn)ITC標(biāo)記Annexin V以及PI在常溫下孵育，大約10 min，利用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，行單因素方差分析，比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 未用藥K562細(xì)胞，呈現(xiàn)懸浮的生長(zhǎng)狀態(tài)，外形圓，胞漿顆粒少，有時(shí)可見(jiàn)空泡;經(jīng)處理后，胞體顯著的變小，核染色質(zhì)也開(kāi)始密閉，核仁逐漸消失，此時(shí)細(xì)胞成呈現(xiàn)為串珠樣，出現(xiàn)了非常多的細(xì)胞碎片或是出芽細(xì)胞。

2.2 聯(lián)苯胺染色 經(jīng)過(guò)0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦參堿作用，陽(yáng)性細(xì)胞的百分比依次為10%，4%以及3%，不同濃度下K562細(xì)胞均呈現(xiàn)了紅系分化的走向，以0.05 mg/mL濃度最為突出。

2.3 苦參堿對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用 從圖1看出，苦參堿濃度變大后，K562細(xì)胞自身的增殖率會(huì)慢慢地遞減;時(shí)間越長(zhǎng)，該趨勢(shì)也會(huì)下降。可見(jiàn)苦參堿的抑制作用，對(duì)劑量-時(shí)間有較強(qiáng)的依賴性。從圖2、表1中看出，0.2、0.5和1.0 mg/mL苦參堿經(jīng)過(guò)48 h作用后，K562細(xì)胞生長(zhǎng)也將明顯地被抑制，抑制率依次為（26.15±5.46）%、（45.9±3.59）%與（63.52±3.12）%，其中有效濃度0.6 mg/mL，基本符合生長(zhǎng)曲線。

2.4 不同濃度苦參堿對(duì)K562細(xì)胞周期的影響 從表2和圖3、4中發(fā)現(xiàn)，0.2 mg/mL苦參堿能夠抑制G0/G1期細(xì)胞，使S期細(xì)胞明顯地?cái)U(kuò)增。當(dāng)苦參堿濃度變大，G0/G1期細(xì)胞也會(huì)明顯地減少，而S期細(xì)胞反倒會(huì)增多。說(shuō)明苦參堿能夠?qū)562細(xì)胞的周期明顯地阻滯于S期，延緩G2/M期進(jìn)程，防止細(xì)胞過(guò)多地有絲分裂，加速細(xì)胞凋亡。

2.5 苦參堿對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡的作用 從圖5不難看出，0.2、0.5以及1.0 mg/mL的苦參堿，誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡百分率依次為5.30%、62.13%以及56.73%，相較于對(duì)照組細(xì)胞原本的自發(fā)凋亡率1.67%明顯更高，以0.5 mg/mL苦參堿尤為突出。當(dāng)苦參堿自身的作用濃度及其時(shí)間延長(zhǎng)后，K562細(xì)胞的壞死占比也在提升。但是，凋亡細(xì)胞占比并未隨之上升，這可能是由苦參堿的作用時(shí)間及其濃度所致。濃度較高或時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞更容易壞死，但不是凋亡。

3 討論

腫瘤的出現(xiàn)，是由于多種基因的非正常表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的過(guò)速增殖與凋亡抑制。故而，控制和預(yù)防腫瘤細(xì)胞的過(guò)速增殖、加速凋亡，這是臨床治療腫瘤的可靠方法。近些年，有人嘗試從祖?zhèn)麽t(yī)學(xué)中尋找新型的抗癌藥物用于腫瘤的治療?？鄥A，實(shí)際上是從苦參根中提取而來(lái)的活性成分。按照中國(guó)藥典的記載，苦參堿能夠達(dá)到抗病毒、消腫以及抗心律失常等多重不同的藥理活性。如今，醫(yī)學(xué)各界也開(kāi)始關(guān)注苦參堿的抗癌效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠抑制人白血病細(xì)胞U937的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且作用呈劑量依賴性關(guān)系[5-7]。

苦參堿可上調(diào)白血病細(xì)胞表面部分NKG2D配體分子的表達(dá)，也可明顯降低急性白血病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平，改善常規(guī)化療藥物療效，促進(jìn)患者康復(fù)[8-13]。本研究以細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法等常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定和對(duì)比了苦參堿對(duì)于在體外人慢粒白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)特性的不同影響，得知苦參堿可以有效地抑制人K562細(xì)胞的過(guò)速生長(zhǎng)，促使K562沿著紅系方向開(kāi)始分化，使細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡。MTT實(shí)驗(yàn)表明：0.2 mg/mL苦參堿能夠防止K562細(xì)胞在體外過(guò)快地生長(zhǎng)，其中有效濃度0.6 mg/mL。當(dāng)濃度擴(kuò)大后，苦參堿對(duì)于K562細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出來(lái)的抑制效應(yīng)與時(shí)間、劑量相關(guān)。本研究中0.2 mg/mL或更多的苦參堿，可以將K562細(xì)胞成功地阻滯于G1→S期，減小細(xì)胞原本的增殖指數(shù)（P<0.01）。在周期轉(zhuǎn)換進(jìn)程中，該指數(shù)比較關(guān)鍵。研究顯示，多種抗癌藥物均是對(duì)細(xì)胞周期內(nèi)部的兩個(gè)時(shí)相轉(zhuǎn)換點(diǎn)G1→S以及G2→M進(jìn)行阻斷，來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，這主要是干擾周期蛋白自身的表達(dá)水平[14-16]。故而，筆者猜測(cè)苦參堿也能夠抑制細(xì)胞中DNA的有效合成，減少有絲分裂，使K562細(xì)胞無(wú)法在體外過(guò)速地增殖。

光學(xué)顯微鏡下，筆者看到苦參堿應(yīng)用后K562細(xì)胞表現(xiàn)出突出的凋亡特點(diǎn)，符合文獻(xiàn)[17-19]報(bào)道。聯(lián)苯胺染色法得知：0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦參堿時(shí)，K562細(xì)胞呈現(xiàn)出紅系分化的走向，0.05 mg/mL時(shí)尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞走向分化、上調(diào)p27kipl蛋白表達(dá)，均是和減少蛋白依賴激酶（CDK）活性產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。p27kipl，是近來(lái)新找到的CDK抑制劑，又被叫作細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，能夠參與細(xì)胞分化[20-21]。除上述外，Annexin V-FITC/PI結(jié)果也提示：苦參堿處理能夠促進(jìn)K562細(xì)胞走向快速地凋亡（P<0.01）。

綜上所述，誘導(dǎo)凋亡應(yīng)該是苦參堿抑制K562細(xì)胞在體外過(guò)速增殖的分子機(jī)制。筆者從實(shí)驗(yàn)中也得出，當(dāng)苦參堿自身的作用濃度及其時(shí)間增加后，K562細(xì)胞的凋亡率仍未變動(dòng)，呈顯著的劑量效應(yīng)。不過(guò)，K562細(xì)胞自身的壞死率有所提升。推測(cè)原因：苦參堿的濃度及其作用時(shí)間，會(huì)帶來(lái)不同的效應(yīng)，高濃度或是作用時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞更容易壞死而不是凋亡。與低濃度或是短時(shí)間作用相比，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能更容易變化。如凋亡，而不是整體結(jié)構(gòu)或是功能的完全喪失。本研究對(duì)臨床用藥或有一定的指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2018-07-10） （本文編輯：周亞杰）