崔 紅，李春華，李正日，李承霖，金海燕，任 寧，汝新宇，李英俊

0引言

糖尿病是一種復(fù)雜的慢性全身性疾病，是20～74歲人群中最常見的主要致盲原因之一，已成為發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家日益嚴(yán)重的公共社會問題[1-2]。糖尿病可引起多種眼部并發(fā)癥，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性角膜病變、代謝性白內(nèi)障等，其中糖尿病引起的干眼癥問題占15%～33%，近幾年成為研究熱點(diǎn)[3]。干眼癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，選擇合適的動物模型是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠類似人類1型糖尿病發(fā)病特征[4-5]，因其可自發(fā)糖尿病，常作為自身免疫性糖尿病小鼠模型，用來研究糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，如糖尿病腎病等。而國內(nèi)未見將其作為糖尿病性干眼模型的報(bào)道，本研究初步探討NOD小鼠作為糖尿病性干眼模型的可行性，并就其眼表變化情況進(jìn)行初步討論，為以后糖尿病性干眼的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料選取40只清潔級雌性NOD/LtJ小鼠，均購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。鼠齡12wk，體質(zhì)量20～25g，無特定病原體，恒溫22℃、濕度55%環(huán)境下正常進(jìn)食飼養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和倫理學(xué)要求。

1.2方法

1.2.1 NOD小鼠糖尿病模型的建立鼠齡12wk開始每周檢測尿糖2次，發(fā)現(xiàn)尿糖強(qiáng)陽性后用血糖儀測血糖，連續(xù)2次血糖≥16.7mmol/L診斷為糖尿病。NOD小鼠被診斷為糖尿病作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)選用未自發(fā)糖尿病的同齡NOD小鼠作為正常對照組。

1.2.2 NOD小鼠糖尿病性干眼模型的建立將實(shí)驗(yàn)組NOD小鼠置于40%以下濕度環(huán)境，每天皮下注射0.5mg/0.2mL氫溴酸菪胺，并置于可控干燥箱中，每天通風(fēng)12h，制作蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組NOD小鼠隨機(jī)分為2組：(1)正常對照組：20只未自發(fā)糖尿病的NOD小鼠。(2)實(shí)驗(yàn)組：干眼1d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第1d組；干眼7d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第7d組；干眼10d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第10d組；干眼14d組：5只糖尿病性干眼模型復(fù)制成功后第14d組。

1.2.4淚液分泌測定采用酚紅棉線試驗(yàn)測量兩組小鼠淚液的分泌量，不同時(shí)間點(diǎn)各選用5只小鼠，分別選取右眼進(jìn)行測定。在裂隙燈下，用眼科顯微鑷夾酚紅棉線，置于小鼠下結(jié)膜囊中外1/3，60s后取出，顯微鏡采用游標(biāo)卡尺觀察棉線濕潤長度，讀數(shù)精確到0.2mm，淚液分泌<5.0mm為低分泌。每組檢查后記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查不同時(shí)間點(diǎn)每組各選取5只小鼠，用頸椎脫臼法處死。用硝酸纖維膜印取每只小鼠的右眼結(jié)膜，將其貼于載玻片上并固定，進(jìn)行過碘酸雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色，使用透明液(10%乙醇∶冰醋酸=7∶3體積比)對纖維膜進(jìn)行透明，載片鏡檢觀察結(jié)膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞改變情況，計(jì)數(shù)穹窿結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目。鏡檢、計(jì)數(shù)由同一專業(yè)人員進(jìn)行，采用單盲法。

圖1小鼠糖尿病性干眼模型組和正常對照組的不同時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量Baseline：NOD小鼠形成糖尿病干眼模型前的淚液分泌量值。

1.2.6角膜組織病理學(xué)檢查頸椎脫臼法處死小鼠，每組各選取5只小鼠，取右眼角膜并經(jīng)中央切開，投入4%多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋切片，采用蘇木精染色檢查，觀察角膜上皮變化情況。

2結(jié)果

2.1各組小鼠淚液分泌結(jié)果正常對照組與實(shí)驗(yàn)組在第1、7、10、14d時(shí)的淚液分泌量情況見表1和圖1。對兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素“分組”“時(shí)間”以及分組和時(shí)間的交互作用進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=9233.79，F(xiàn)時(shí)間=626.42，F(xiàn)組間×?xí)r間=628.16，均P<0.001)。在造模后的第1、7、10、14d，淚液分泌量較正常對照組均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且從造模后第1d開始，隨造模時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組的淚液分泌量隨時(shí)間而逐漸減少，于14d時(shí)淚液分泌量達(dá)到最低，而正常對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的淚液分泌量未有明顯變化。

2.2各組小鼠結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果正常對照組的NOD小鼠結(jié)膜細(xì)胞小而圓，數(shù)量多，連接緊密，杯狀細(xì)胞核圓，胞質(zhì)易辨認(rèn)，上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞比約1∶1以上。建立糖尿病性干眼模型第1d，結(jié)膜細(xì)胞變大，細(xì)胞間距較正常對照組增大，核漿比減小，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞比約2∶1以上。第7d，杯狀細(xì)胞數(shù)量極少，核質(zhì)比率=1/5。第10d，結(jié)膜細(xì)胞鱗狀化生化占結(jié)膜細(xì)胞1/2。第14d結(jié)膜細(xì)胞呈重度鱗狀化生化(圖2)。

2.3各組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比較對兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素“分組”“時(shí)間”以及分組和時(shí)間的交互作用進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=408.15，F(xiàn)時(shí)間=38.57，F(xiàn)組間×?xí)r間=14.62，均P<0.001，表2)。在造模后的第1、7、10、14d，杯狀細(xì)胞密度較正常對照組均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；從造模后第1d開始，隨造模時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組杯狀細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；而正常對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的杯狀細(xì)胞數(shù)量未有明顯變化。

2.4各組小鼠角膜蘇木精染色結(jié)果正常對照組和糖尿病性干眼模型第10d組角膜病理切片見圖3。正常對照組角膜病理切片可見5層角膜上皮細(xì)胞，形態(tài)清晰、排列緊密。實(shí)驗(yàn)組角膜上皮層變薄，部分上皮細(xì)胞變性，部分基底細(xì)胞水腫。

圖2各組小鼠結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查(過碘酸-希夫染色×200)A：正常對照組；B：干眼1d組；C：干眼7d組；D：干眼10d組；E：干眼14d組。

圖3各組小鼠角膜病理切片(蘇木精染色×200)A：正常對照組；B：干眼10d組。

分組基礎(chǔ)值第1d第7d第10d第14d正常對照組6.62±0.076.50±0.096.58±0.106.49±0.056.68±0.10實(shí)驗(yàn)組6.48±0.213.82±0.07a2.52±0.08a3.26±0.15a2.22±0.05at1.39751.48174.75146.47690.106P0.200<0.001<0.001<0.001<0.001

注：基礎(chǔ)值：NOD小鼠形成糖尿病干眼模型前的淚液分泌量值；aP<0.05vs同一時(shí)間點(diǎn)對照組。

表2 各組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比較 個(gè)/cm2)

注：aP<0.05vs同一時(shí)間點(diǎn)對照組。

3討論

糖尿病引起的并發(fā)癥可累及全身各個(gè)系統(tǒng)及器官，其中糖尿病相關(guān)性眼病是其中一個(gè)主要并發(fā)癥[6]，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性角膜病變、代謝性白內(nèi)障等。近年來，糖尿病并發(fā)的干眼癥問題因其對眼表的損害可造成視力下降而引起廣泛關(guān)注[7]。動物模型實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行糖尿病性干眼研究必不可少的環(huán)節(jié)，選擇合適的動物模型是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)1型糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的研究大多采用左脲鏈霉素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動物模型，但該模型并沒有完全模擬出1型糖尿病發(fā)病的免疫機(jī)制，且常有自愈傾向，不利于長期觀察。而NOD小鼠是一種廣泛使用的研究1型糖尿病的動物模型[8]，其自發(fā)性糖尿病發(fā)病率較高，且雌性小鼠更易患病。

干眼癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥和損害以及神經(jīng)感覺異常[9]，根據(jù)病因不同可分為淚液分泌不足型干眼和蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼。NOD小鼠因其器官特異性自身免疫的特性可使淚腺發(fā)生自身免疫性病變[10]，使得NOD小鼠成為研究干眼癥的合適模型。然而，NOD小鼠是否適合建立糖尿病性干眼模型，在國內(nèi)未曾報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取雌性NOD/LtJ品系小鼠(均購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室)，將實(shí)驗(yàn)組小鼠置于40%以下濕度環(huán)境，每天皮下注射0.5mg/0.2mL氫溴酸菪胺，并置于可控干燥箱中，每天通風(fēng)12h，制作蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型，這也符合臨床干眼癥發(fā)病的病理生理過程。

本研究中，通過對兩組NOD小鼠進(jìn)行淚液分泌量測定、結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)形態(tài)檢查、結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度數(shù)測定和角膜病理切片染色，比較兩組小鼠的眼表情況，以初步探討NOD小鼠作為糖尿病性干眼模型的可行性。本實(shí)驗(yàn)采用酚紅棉線測量淚液分泌量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組NOD小鼠的淚液分泌量在不同時(shí)間點(diǎn)較正常對照組減少，并且從建立糖尿病性干眼模型的第1～14d，實(shí)驗(yàn)組淚液分泌量逐漸減少并達(dá)到最低值，由此可知實(shí)驗(yàn)組小鼠淚液分泌量隨造模時(shí)間逐漸減少。有研究表明，淚膜穩(wěn)定性可受角結(jié)膜細(xì)胞成分、結(jié)膜炎癥狀態(tài)與增生情況所影響[11]，并且結(jié)膜杯狀細(xì)胞具有維持眼表穩(wěn)定性等作用，當(dāng)結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度降低時(shí)，引起眼表黏蛋白分泌減少，淚膜穩(wěn)定性與功能性也就變差[12]，是反映眼表健康的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用PAS染色方法對兩組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞進(jìn)行檢查與計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠結(jié)膜細(xì)胞小而圓，數(shù)量多，連接緊密，杯狀細(xì)胞核圓，胞質(zhì)易辨認(rèn)，實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量不斷減少、體積變大，結(jié)膜細(xì)胞不斷向鱗狀上皮化生。在不同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量較正常對照組均減少。我們還發(fā)現(xiàn)，從造模第1d開始，實(shí)驗(yàn)組杯狀細(xì)胞密度隨著造模時(shí)間而逐漸降低，而正常對照組在不同時(shí)間點(diǎn)上未有明顯變化?？梢奛OD小鼠建立蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型，可表現(xiàn)為眼表淚液分泌量減少，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少，結(jié)膜細(xì)胞變大且鱗狀上皮化，而杯狀細(xì)胞密度隨著造模時(shí)間逐漸減低的原因可能與干眼的嚴(yán)重程度有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)[13]，干眼癥患者角膜上皮厚度是變薄的，同時(shí)當(dāng)淚液分泌不足或者眼表蒸發(fā)過強(qiáng)時(shí)可導(dǎo)致淚膜厚度降低。本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精染色觀察角膜病理組織切片，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠角膜上皮層變薄，部分上皮細(xì)胞變性，部分基底細(xì)胞水腫，這些發(fā)現(xiàn)與臨床上干眼癥表現(xiàn)是一致的[14]。由此我們可推測，NOD小鼠眼表損害不斷加重使其角膜上皮完整性被不斷破壞，而臨床上角膜上皮點(diǎn)狀著色可能與其有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步建立了NOD小鼠干眼模型，該模型可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，采用淚液分泌量測定、結(jié)膜組織PAS染色、角膜上皮蘇木精染色等方法顯示，其眼表變化與臨床上干眼癥表現(xiàn)類似。但本研究仍有不足之處，所選取小鼠樣本少，且本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢H是初步建立，其可行性與科學(xué)性還需有大量實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。