王聞翰，劉吉華

(江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

青蒿素是由我國(guó)科學(xué)工作者在植物黃花蒿中發(fā)現(xiàn)的、并具有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物。青蒿素藥理活性廣泛，同時(shí)具有抗瘧，抗炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種生理活性[1-6]，尤其在抗瘧方面具有顯著療效，曾被世界衛(wèi)生組織稱為“世界唯一有效的瘧疾治療藥物”[7]。但青蒿素的水溶性差、生物利用度低、生物半衰期短、潛在腦干神經(jīng)損傷等不足限制其在臨床上的應(yīng)用[8]。因此，對(duì)青蒿素類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，尋找新的有效的青蒿素衍生物勢(shì)在必行，目前青蒿素的主要衍生物有雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯等。為了獲取更多高效低毒的青蒿素衍生物，結(jié)構(gòu)修飾已經(jīng)成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。結(jié)構(gòu)修飾包括傳統(tǒng)化學(xué)修飾和微生物轉(zhuǎn)化修飾，本文重點(diǎn)介紹微生物轉(zhuǎn)化修飾，它為青蒿素類化合物的結(jié)構(gòu)修飾及應(yīng)用發(fā)展開(kāi)辟了新道路。

微生物轉(zhuǎn)化是某種微生物通過(guò)一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)(產(chǎn)物)的過(guò)程，類固醇、生物堿、香豆素、黃酮類和萜類都可以由真菌、酵母、細(xì)菌、植物細(xì)胞和這些來(lái)源的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[9]。其本質(zhì)是酶促催化反應(yīng)，與傳統(tǒng)化學(xué)修飾相比較，具有高效、溫和、成本小、手性選擇及位置選擇強(qiáng)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。在不改變?cè)衔锬负说那疤嵯拢梢源呋S多化學(xué)修飾中難以進(jìn)行的反應(yīng)。常見(jiàn)的微生物轉(zhuǎn)化類型有：羥化反應(yīng)、酰基化反應(yīng)、縮合反應(yīng)、糖基化反應(yīng)、水解反應(yīng)等，它們?cè)谇噍锼仡惢衔锏慕Y(jié)構(gòu)修飾中扮演中重要作用，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的青蒿素類化合物不僅增加衍生物種類，提高其水溶性，生物利用度及藥理活性，而且擴(kuò)展新藥理活性及為體內(nèi)代謝組學(xué)研究提供新方向。

圖1 青蒿素、雙氫青蒿素及其衍生物結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural diagram of artemisinin, dihydroartemisinin and their derivatives

1 微生物轉(zhuǎn)化在青蒿素類化合物研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于天然化合物的合成、結(jié)構(gòu)修飾、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及藥物代謝機(jī)制研究等，是獲得結(jié)構(gòu)新穎，高效、低毒化合物的重要途徑?；谖⑸镛D(zhuǎn)化在天然藥物中的廣泛應(yīng)用，本文就青蒿素類化合物微生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行以下幾個(gè)方面的總結(jié)。

1.1 增加衍生物的種類

微生物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于天然化合物的合成和結(jié)構(gòu)修飾當(dāng)中，為創(chuàng)造新穎、獨(dú)特、高效、低毒的藥用化合物分子提供了可能。由于青蒿素類化合物過(guò)氧橋的不穩(wěn)定性，傳統(tǒng)化學(xué)修飾大部分停留在其C-12位的進(jìn)行衍生化，包括C-O鍵、C-N鍵、C-S鍵衍生物，少部分對(duì)C-13、C-14位的甲基進(jìn)行修飾。對(duì)于沒(méi)有取代基的其他位置C原子，很難進(jìn)行衍生化，大大制約了青蒿素類衍生物的制備及其活性研究。而微生物由于其特異選擇性，能夠在青蒿素類化合物的C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-14等位置進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，大大豐富了青蒿素衍生物的種類，如表1所示。

1.2 提高水溶性，增加生物利用度

大多數(shù)青蒿素類化合物利用微生物在青蒿素結(jié)構(gòu)中引入羥基、氨基、羧酸基等親水性基團(tuán)，可增加其水溶性，提高生物利用度。Parshikov[13]通過(guò)黑曲霉(Aspergillusniger)將青蒿素成功轉(zhuǎn)化為9β-羥基青蒿素，并根據(jù)分子模型和結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，證明了青蒿素的C-2、C-3、C-9位衍生物具有增加水溶性且最大程度地保證抗瘧活性。Zhan[28]研究了雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)對(duì)青蒿素的微生物轉(zhuǎn)化，得到4種分離產(chǎn)物分別為6β-羥基青蒿素，7α-羥基青蒿素，7β-羥基青蒿素和6β,7α-二羥基青蒿素，其中化合物6β,7α-二羥基青蒿素為新化合物。由于缺乏官能團(tuán)，在C-6或C-7位置的青蒿素衍生物的化學(xué)合成是不可能的，但生物轉(zhuǎn)化的手段可對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并且6β,7α-二羥基青蒿素由于親水基團(tuán)羥基的引入，其構(gòu)效研究表明抗瘧活性和水溶性均比青蒿素有所增加。

1.3 提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物藥理活性

微生物轉(zhuǎn)化可在化學(xué)合成難以實(shí)現(xiàn)的位點(diǎn)上進(jìn)行修飾，部分產(chǎn)物可獲得比底物更高的藥理活性，為尋找更高效低毒的先導(dǎo)化合物提供途徑。Gaur[16]運(yùn)用匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifer)對(duì)抗瘧藥青蒿素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化, 得到3種青蒿素衍生物：1α-羥基青蒿素，10β-羥基青蒿素和脫氧青蒿素，其中10β-羥基青蒿素化學(xué)轉(zhuǎn)化為10β-羥基-12β-蒿甲醚，其在惡性瘧原蟲(NF54菌株)的抗瘧IC50值為18.29 nmol/L，比其前體10β-羥基青蒿素的活性高出10倍。Khalifa[24]運(yùn)用淡紫灰鏈霉菌(StreptomyceslavendulaeL-105)微生物轉(zhuǎn)化青蒿素，得到11,12-脫水雙氫青蒿素，并測(cè)定了11,12-脫水雙氫青蒿素在Indochina細(xì)胞上的抗瘧IC50值為0.35 g/L，較青蒿素下降了一半。Parshikov[29]采用雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)的液體培養(yǎng)物將青蒿素生物轉(zhuǎn)化為7β-羥基青蒿素，產(chǎn)率為78.6%，其分子模型與構(gòu)效活性研究表明，7β-青蒿素骨架的衍生化使其抗瘧活性顯著增加。

表1 青蒿素類化合物微生物轉(zhuǎn)化

1.4 擴(kuò)展新的藥理方向

除了傳統(tǒng)抗瘧活性外，部分青蒿素的衍生物具有良好的抗癌活性。Liu[30]運(yùn)用灰色鏈霉菌(StreptomycesgriseusATCC13273)將青蒿素轉(zhuǎn)化為9α-羥基青蒿素，Xu[17]在此基礎(chǔ)上成功用該菌株將雙氫青蒿素轉(zhuǎn)化為9α-羥基雙氫青蒿素，并以肉桂酸修飾9α-羥基雙氫青蒿素，得到9α-羥基雙氫青蒿素-肉桂酸衍生物，對(duì)其進(jìn)行PC-3，SGC-7901，A549和MDA-MB-435s癌細(xì)胞系的體外抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，9α-羥基雙氫青蒿素-肉桂酸衍生物可有效抑制A549肺癌細(xì)胞增殖(IC50=0.20 mmol/L)，并且對(duì)正常肝L-02細(xì)胞表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性，其機(jī)制為9α-羥基雙氫青蒿素-肉桂酸衍生物誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡，并且使細(xì)胞內(nèi)活性氧簇濃度及亞鐵離子濃度升高，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。Goswami[14]通過(guò)單利青霉菌(Penicilliumsimplissimum)將青蒿素修飾為3α-羥基青蒿素和3β-乙酰氧基青蒿素，并且證明了3α-羥基青蒿素和3β-乙酰氧基青蒿素對(duì)HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

1.5 為體內(nèi)代謝組學(xué)的研究提供方向

微生物是體外研究基本生命過(guò)程的理想模型，其代謝產(chǎn)物與人體內(nèi)代謝產(chǎn)物具有高度的相似性。Ma[31]運(yùn)用秀麗隱桿線蟲(CaenorhabditiselegansCICC 40250)開(kāi)發(fā)模擬體內(nèi)青蒿素代謝的體外微生物模型，通過(guò)UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的代謝物和小鼠灌胃給藥青蒿素的血漿，鑒定了體外微生物轉(zhuǎn)化的32種代謝物和小鼠血漿的23種代謝物。經(jīng)比較，兩種模型有16種代謝產(chǎn)物是相同的，由此說(shuō)明秀麗隱桿線蟲(CaenorhabditiselegansCICC 40250)模擬體內(nèi)青蒿素代謝具有相當(dāng)?shù)南嗨菩?。Han[18]分別用藍(lán)色犁頭霉菌(Absidiacoerulea)和產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)對(duì)雙氫青蒿素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到脫氧二氫青蒿素，8α-羥基脫氧青蒿素，脫氧青蒿素和9α-羥基青蒿素、3α-羥基脫氧二氫青蒿素初級(jí)代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)研究表明藍(lán)色犁頭霉菌(Absidiacoerulea)和產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)對(duì)雙氫青蒿素的微生物代謝通過(guò)脫氧、異構(gòu)化和羥基化產(chǎn)生，且研究表明[32]其初級(jí)代謝產(chǎn)物后續(xù)進(jìn)行葡萄糖醛酸化過(guò)程，與哺乳動(dòng)物的雙氫青蒿素代謝相似[33]，這表明微生物轉(zhuǎn)化與體內(nèi)代謝途徑具有高度相似性，對(duì)模擬青蒿素的體內(nèi)代謝研究具有一定的參考作用。

2 小結(jié)與展望

微生物轉(zhuǎn)化是改變青蒿素及其衍生物結(jié)構(gòu)的重要手段，青蒿素微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不但增加了水溶性，而且為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾提供了活性位點(diǎn)，為新藥研發(fā)開(kāi)辟新思路，但目前微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)尚存在較大的局限與諸多不足之處，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。微生物轉(zhuǎn)化的作用位點(diǎn)和構(gòu)型是由底物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和微生物體酶系共同決定的，不同微生物體系轉(zhuǎn)化底物得到的產(chǎn)物數(shù)量、種類和得率各有不同，因此，優(yōu)良菌種的選育是微生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵條件。在轉(zhuǎn)化的最初設(shè)計(jì)中, 菌種選育往往是最耗時(shí)耗力的工作，而且菌株一旦發(fā)生變異，酶系類型也可能發(fā)生變化，目標(biāo)產(chǎn)物可能隨之改變。其次，菌種的代謝產(chǎn)物復(fù)雜，轉(zhuǎn)化之后的成分鑒定和分離純化工作程序繁瑣, 增加了工業(yè)化的成本，這也是影響微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)的障礙之一。另外，菌種的代謝酶屬于生物制品，對(duì)熱及pH敏感，易失活和變性，催化能力有限，這也是影響工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用的主要障礙之一。因此為了增加生物合成效率，應(yīng)增加對(duì)轉(zhuǎn)化菌株酶系的研究，利用基因工程手段構(gòu)建工程菌和篩選菌株，優(yōu)化條件，提高轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)量，增強(qiáng)催化活性，闡明底物在特定酶系下的轉(zhuǎn)化過(guò)程和轉(zhuǎn)化機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程可控，并且可以多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的目標(biāo)。