馬玉紅，韓 瑾，陸軍燕，陸 萍，陳基強(qiáng)，楊濟(jì)敏，彭擁花，劉玉娟

(1.東莞康華醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東 東莞 523080；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)又稱宮內(nèi)生長受限，是指胎兒體重低于其孕齡平均體重的第10百分位數(shù)或低于其平均體重的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，是產(chǎn)科最常見也是最復(fù)雜的病癥之一[1]。FGR可增加胎兒窘迫、新生兒窒息等圍產(chǎn)期并發(fā)癥發(fā)病率和圍產(chǎn)兒死亡率，可導(dǎo)致出生后發(fā)育及智力發(fā)育落后，成年后代謝綜合征易感性增加。FGR病因復(fù)雜，孕婦、胎兒、胎盤和臍帶的異常因素均是其危險(xiǎn)因素，其中胎兒染色體異常是導(dǎo)致FGR的重要原因之一。染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)技術(shù)可以檢測全基因組水平染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)，還可檢測嵌合體(嵌合比例>20%)、雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)及單親二倍體(uniparental disomy，UPD)等，目前已被廣泛應(yīng)用于胎兒結(jié)構(gòu)畸形、原發(fā)性智力低下、生長發(fā)育遲緩、自閉癥、多發(fā)畸形等異常的診斷及腫瘤遺傳學(xué)診斷等領(lǐng)域[2]。本研究應(yīng)用全基因組CMA技術(shù)對55例產(chǎn)前超聲診斷的FGR胎兒進(jìn)行檢測，探討FGR胎兒的基因組學(xué)病因及CMA技術(shù)在該類胎兒中的診斷應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇2015年1月至2018年6月在東莞康華醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心和產(chǎn)科診斷為FGR病例55例，孕婦年齡為28～42歲，孕周為22～34周。將FGR胎兒分為單純性FGR組(33例)和FGR合并其他超聲異常組(22例)。

1.2方法

產(chǎn)前診斷孕婦均填寫基本信息登記表，包括年齡、體重、末次月經(jīng)、種族、生育史、疾病史、家族遺傳病史，孕婦在本次妊娠期間是否接觸過病毒及明顯致畸物質(zhì)。所有病例需排除由明確母體因素引起的FGR，如妊娠期高血壓疾病及母體營養(yǎng)因素異常等。所有研究對象均簽署知情同意書，取得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3儀器的選擇

CMA的檢測按照美國Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan HD芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，應(yīng)用配套的ChAS軟件及生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析診斷，CytoScan HD芯片同時(shí)具備195萬個(gè)CNV探針和75萬個(gè)SNP探針。

1.4產(chǎn)前診斷

在孕婦及家屬知情同意下，自愿選擇超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)(16～24周)或臍帶血穿刺術(shù)(>24周)，獲得胎兒羊水或臍血樣本。孕婦取仰臥位，常規(guī)腹壁消毒，超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺或臍帶血穿刺術(shù)，獲取胎兒標(biāo)本(羊水20mL或臍帶血1.5mL)。同時(shí)抽取其家系成員外周血2mL注入EDTA抗凝管中，顛倒混勻后置于4℃冰箱中保存，剩余標(biāo)本置-80℃保存。

1.5 CMA數(shù)據(jù)分析

采用ChAS 2.0軟件，選取長度≥100kb缺失/重復(fù)片段(可信度≥90%)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)為CEL文件格式。根據(jù)CNVs的性質(zhì)不同，將其分為致病性CNVs、不明確意義CNVs(variants of unknown significance，VOUS)及良性CNVs三類。數(shù)據(jù)分析包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫及在線公共數(shù)據(jù)庫，如OMIM(http：//www.omim.org)、DGV(http：//www.projects.tcag.ca/variation)、DECIPHER(http：//www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher)、USCS(http：//genome.ucsc.edu)及PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，應(yīng)用校正χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CMA的研究情況

在55例FGR樣本中，致病性CNVs檢出8例，檢出率為14.5%(8/55)，病理性CNV病例見表1；其中單純性FGR組致病性CNVs檢出率為9.1%(3/33)，F(xiàn)GR合并其他超聲異常組致病性CNVs檢出率為22.7%(5/22)，片段小于5Mb致病性CNVs占5.4%(3/55)，檢出VOUS占3.6%(2/55)。

表1 8例病理性CNV產(chǎn)前超聲和CMA結(jié)果

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

病例序號產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)CMA結(jié)果異常片段大小染色體病,微缺失微重復(fù)綜合征和關(guān)鍵基因推測表型7FGRarr(h19)Xq26.1q26.3(13006-3290-133719843)X23.66MbIGSF1FRMD7GPC3PHF6HPRT1精神運(yùn)動發(fā)育遲緩,智力障礙,小頭畸形,異常面容8FGRarr(h19)12p13.3p13.3(1737-86-6648855)X1arr(h19)19q13.4113.43(51676567-58956816)X36.48Mb7.28Mb12p缺失綜合征19q重復(fù)綜合征智力障礙,先天性腎囊腫,生長發(fā)育遲緩,胼胝體發(fā)育不良,脊柱側(cè)凸

注：*見圖1，**見圖2。

2.2產(chǎn)后隨訪情況

對全部病例進(jìn)行了電話隨訪及產(chǎn)后超聲復(fù)查，了解患者妊娠結(jié)局，其中12例選擇引產(chǎn)，40例分娩，3例失訪；在40例分娩的病例中，除1例出現(xiàn)精神運(yùn)動發(fā)育遲緩?fù)猓溆嗌L發(fā)育評估基本正常。

2.3單純性FGR組與FGR合并其他超聲異常組CNVs檢出情況

單純性FGR組、FGR合并其他超聲異常組CNVs檢出率分別為9.1%(3/33)和22.7%(5/22)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.843，P=0.358)。不同性質(zhì)CNVs的檢出率見表2。

表2 55例FGR病例不同性質(zhì)CNVs的檢出比較結(jié)果[n(%)]

圖1 Wolf-Hirschhorn綜合征(WHS)典型病例3的CMA圖

圖2 Williams-Beure綜合征(WBS)典型病例5的CMA圖

3討論

3.1 FGR發(fā)病原因及機(jī)制

FGR發(fā)病原因及機(jī)制較為復(fù)雜，母體因素、多胎、胎兒感染和遺傳因素等均可能導(dǎo)致FGR。在遺傳因素中，染色體異常是導(dǎo)致FGR的重要原因之一，其中最常見的是染色體三體，如18三體和13三體綜合征，還有染色體結(jié)構(gòu)異常等病因[3]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、基因研究方法的不斷涌出及基因組序列改變引發(fā)胚胎發(fā)育異常相關(guān)研究的深入，越來越多的基因組異常疾病被發(fā)現(xiàn)與FGR有關(guān)。本研究所使用的CNVs檢測技術(shù)具有高分辨識別基因組不平衡CNV、UPD及較低水平嵌合體的CMA技術(shù)，在快速識別和鑒定疾病相關(guān)基因方面具有較高的優(yōu)勢。2014年8月，國內(nèi)亦達(dá)成了“CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識”，進(jìn)一步明確了CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值[4]。

3.2 CMA檢測結(jié)果分析

本研究采用Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平臺共計(jì)對55例FGR病例進(jìn)行了檢測，對臨床實(shí)踐具有較好的指導(dǎo)意義。本研究顯示，F(xiàn)GR合并其他超聲異常組的CNVs檢出率為22.7%(5/22)，顯著高于單純性FGR組的9.1%(3/33)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，合并的畸形主要為心血管畸形和神經(jīng)系統(tǒng)異常。吳星等[5]的研究中提出單純性FGR和合并其他結(jié)構(gòu)畸形的檢出率分別為11.1%和18.4%，與本研究結(jié)果類似。

3.3核型分析與CMA技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)的比較

染色體核型分析作為傳統(tǒng)的檢測方法用于產(chǎn)前診斷多年，可檢測全基因組水平染色體數(shù)目或較大的結(jié)構(gòu)異常。本研究中有2例為常見的18三體病例。常規(guī)的G顯帶核型分析只能檢測到10Mb以上的染色體片段異常，即使高分辨G顯帶核型分析也較難檢出小于5Mb的染色體變異，而且對細(xì)胞培養(yǎng)要求較高，臨床實(shí)施困難。在本研究8例CMA異常病例中，有3例CNVs片段小于5Mb，更說明應(yīng)用CMA的臨床價(jià)值；采用CMA技術(shù)不僅可以檢測出常規(guī)染色體核型異常，還可額外檢出5.4%(3/55)染色體組的異常。另外在本研究的病例中，致病性片段染色體的分布分別為4p16.3、7q11.2、12p13.3、19p13.3、19q13.4和Xq26.1，分布在不同的染色體，且無明確的規(guī)律性，進(jìn)一步證實(shí)了FGR的遺傳學(xué)病因除了與染色體結(jié)構(gòu)異?；蚍钦扼w有關(guān)，還與不同染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。因此說明高分辨全基因組水平檢測技術(shù)對FGR的病因?qū)W檢測具有一定的優(yōu)勢[6]。無論是單純性還是合并其他結(jié)構(gòu)畸形的FGR患者，首先推薦CMA進(jìn)行遺傳學(xué)病因的檢測。

3.4特殊病例的分析

本研究發(fā)現(xiàn)病例3和病例4診斷為Wolf-Hirschhorn綜合征(WHS)，該病新生兒的發(fā)病率為1/50 000，關(guān)鍵區(qū)域在染色體4p16.3的165kb范圍內(nèi)，為開始形成受精卵的早期發(fā)育過程中隨機(jī)出現(xiàn)的染色體缺失，也可為4號環(huán)狀染色體或父母一方為4號染色體短臂的平衡異位攜帶者等原因所造成，由于其患兒臨床特征性的外貌，即寬鼻梁、前額突出、眼距寬、大而突出的眼睛、小下頜、嘴角下垂等表現(xiàn)，也稱為“希臘武士頭盔”的面容，該類患兒出生后有生長發(fā)育障礙、智力低下、肌張力減退、癲癇、先心病、骨骼畸形等各種異常。WHS的典型體征和癥狀與4號染色體短臂末端多種基因的丟失有關(guān)，丟失片段的大小決定了個(gè)體體征異常的程度，丟失片段大的較片段小的有更嚴(yán)重的智力障礙。本研究2例的缺失片段大小分別為8.65Mb和3.84Mb，屬于較為常見的類型[7]，可在出生后很大程度上表現(xiàn)出WHS的表型特征。

本研究中還發(fā)現(xiàn)病例5為Williams-Beure綜合征(WBS)，超聲顯示除生長發(fā)育遲緩，還存在腎臟發(fā)育異常，產(chǎn)前診斷為7號染色體長臂1.45Mb缺失，包括25～30個(gè)基因，7q11.23區(qū)域低拷貝重復(fù)序列(low copy repeats，LCR)重排是WBS患者發(fā)病的原因，大約95%的WBS患兒存在的1.5～1.8Mb缺失，即典型缺失，這些缺失中2/3是因減數(shù)分裂過程中7號染色體同源重排所致，1/3是由染色體內(nèi)的重排所致，此類父母的WBS區(qū)域發(fā)生了7號染色體臂內(nèi)倒位是重要原因之一。WBS患兒出生后的臨床表現(xiàn)為特殊面容，表現(xiàn)為“精靈面容”，張嘴突唇、牙齒稀疏、咬合不正、心血管主動脈瓣上狹窄是最常見的臨床表現(xiàn)，患兒有智力發(fā)育遲緩，語言能力和聽覺機(jī)械記憶能力很強(qiáng)，視覺空間的構(gòu)建能力很差，15%有特征性地先天性高鈣血癥[8]。

病例6為羊水CMA發(fā)現(xiàn)為19p重復(fù)綜合征[9]。病例7是男性胎兒,為IGSF1、FRMD7、GPC3、PHF6、HPRT1缺失，主要臨床表現(xiàn)為精神運(yùn)動發(fā)育遲緩、智力障礙、小頭畸形、共濟(jì)失調(diào)等[10]。病例8為12p6.48Mb缺失和19q7.28Mb的重復(fù)，12p13.33微缺失綜合與19q13.4重復(fù)相互協(xié)同，也主要表現(xiàn)為智力障礙，生長發(fā)育遲緩，腦發(fā)育異常和器官的異常，建議對父母行染色體的檢查，排除其中一方患有染色體的平衡易位[11]。但由于本研究中的病例絕大多數(shù)來自外院轉(zhuǎn)診，在獲知胎兒存在病理性CNV后，多選擇終止妊娠，因而缺乏對CMA結(jié)果和相應(yīng)病例遠(yuǎn)期預(yù)后的隨訪評估結(jié)果。

CMA技術(shù)也有一定的局限性，在臨床實(shí)踐中可能會發(fā)現(xiàn)大量的臨床意義不明確的VOUS，這將會給遺傳咨詢與臨床處理帶來困難，VOUS的檢出率取決于微陣列芯片的類型和研究的群體，因此建議對病例的父母進(jìn)行基因組DNA的檢測。CMA檢測前與檢測后的遺傳咨詢非常重要，檢測前需要孕婦及其家屬簽署知情同意書，內(nèi)容包括CMA技術(shù)的優(yōu)勢、局限性和可能的結(jié)果，檢測后也應(yīng)具備對不同的臨床報(bào)告結(jié)果解讀的能力，并能夠提供與之相對應(yīng)的具體的臨床處理方式和流程。