張永兵，李寐華，張學軍，楊 永，伊鴻平

(新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆甜瓜(CucumismeloL.)的栽培歷史悠久，地方品種資源數量多、分布廣，新疆獨特的生態(tài)氣候條件下種植生產的甜瓜即哈密瓜質地松脆、風味獨特，是新疆的重要經濟作物之一[1]。20世紀80年代，甜瓜育種家吳明珠院士團隊利用遠生態(tài)和多親復合雜交技術選育出皇后及多份穩(wěn)定的姊妹系材料，皇后(品種審定名新密1號)的選育拓寬了哈密瓜的遺傳背景，使該品種既保留了哈密瓜特有的風味又改良了哈密瓜地方品種的抗病性和適應性，成為當時我區(qū)哈密瓜商品生產基地的主栽品種，實現了我區(qū)哈密瓜品種第一次更新換代，也為后期哈密瓜的雜種優(yōu)勢利用奠定了材料基礎[2，3]。在農作物雜種優(yōu)勢利用中，親本選擇是配制優(yōu)勢組合、有效利用雜種優(yōu)勢的關鍵環(huán)節(jié)，全面、系統的了解親本材料的親緣關系和遺傳多樣性，有助于減少親本選配的盲目性、提高新品種的選育效率[4]?！厩叭搜芯窟M展】以往判斷親本間的遺傳差異或親緣關系常常通過農藝性狀，但農藝性狀易受到時空和經驗的限制，而DNA分子標記不受基因表達的時空限制和環(huán)境人為條件的影響，在研究農作物骨干育種材料遺傳差異和多樣性方面得到廣泛應用[5-8]。盡管在分子水平對新疆甜瓜地方品種進行了遺傳多樣性和親緣關系的分析[9-11]，但針對皇后姊妹系及其選育親本材料間遺傳關系的研究仍未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】20世紀末雜種優(yōu)勢育種研究中，皇后是新疆哈密瓜重要的骨干親本材料[3]?；屎箧⒚孟导捌洳糠诌x育親本材料是穩(wěn)定的優(yōu)良自交系，均可作為哈密瓜雜種優(yōu)勢利用的骨干親本材料，對這些骨干親本材料進行遺傳多樣性的分析，將有助于哈密瓜雜優(yōu)育種中親本的選配和利用效率的提高?！緮M解決的關鍵問題】以ISSR標記方法，對皇后及其姊妹系以及其它選育親本材料進行遺傳多樣性和遺傳關系研究，為新疆哈密瓜新品種選育和遺傳改良提供支撐，為哈密瓜骨干育種材料中特異基因的挖掘研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

親本材料中含笑是金棒子和紅心脆雜交后系譜選育出的常規(guī)品種。供試材料均由新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心提供。ISSR引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

取每份材料3～5個單株生長頂端的1片幼嫩葉片，混合在一起，液氮速凍研磨后，采用CTAB法[12]提取基因組DNA。取每份材料基因組DNA溶液2 μL，利用Q3000超微量紫外分光光度計檢測各樣品基因組DNA濃度及純度，將DNA的濃度調整至約20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料名稱、來源和原產地
Table 1 Name, source and origin of materials tested

編號Code品種名Name來源Source原產地OriginP1香梨黃地方品種中國吐魯番市P2黃皮紅肉冬瓜地方品種中國南疆地區(qū)P3金棒子地方品種中國吐魯番市P4含笑金棒子 × 紅心脆中國鄯善縣P5紅心脆地方品種中國皮山縣P6金黃引進抗源美國L1皇后85系穩(wěn)定自交系-L2皇后86系穩(wěn)定自交系-L3皇后88系穩(wěn)定自交系-L4皇后穩(wěn)定自交系-L5青邊皇后穩(wěn)定自交系-L6青皮皇后穩(wěn)定自交系-

1.2.2 ISSR-PCR擴增和電泳檢測

ISSR-PCR反應體系為：10 × buffer (不含Mg2+)2.0 μL; dNTP (2 mmol/L) 2.0 μL; MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL; 引物(10 mmol/L)1.0 μL；模板DNA (30 ng/μL)1.0 μL;Taq聚合酶(5U/μL)0.2 μL; ddH2O 12.3 μL，共20 μL。

PCR反應在DNA PTC-200(東勝創(chuàng)新生物技術有限公司)上進行。反應程序如下：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，進行35個循環(huán)，在72℃下繼續(xù)延伸10 min，4℃保存，整個反應程序約2.5 h。

電泳檢測時，取10 μL PCR反應產物與1.5 μL溴酚藍(0.25%)混合，點樣于含0.5 μg/mL EB的1.5%瓊脂糖凝膠中，以1×TAE為電泳緩沖液，在5V/cm穩(wěn)定電壓下電泳1.5 h左右。用JS-380B數碼凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進行分析。

1.3 數據處理

利用Quantity one 軟件將300～1 500 bp清晰可見的條帶進行標記，經過match比對后，輸出由0和1構成的原始數據矩陣。在相同遷移率的位置有條帶為“1”，無條帶為“0”。利用Popgen1.32軟件分析遺傳多樣性的指標，包括Nei基因多樣性指數(Neis Gene Diversity)和Shannon信息指數(Shannons Information Index)。利用軟件NTSYSpc2.10計算供試材料之間的遺傳相似系數(Jaccard Similarity Coefficient, JC)，按照非加權成對群算數平均法(Un-weighted Pair Group Method with Arithmetic means，UPGMA)進行聚類分析和主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。

2 結果與分析

2.1 姊妹系和親本材料的遺傳多樣性

共篩選了200條ISSR引物，多態(tài)性引物為65條，多態(tài)性引物所占比例為32.50%。根據Marker遷移距離，ISSR擴增條帶大小范圍約為300～1 500 bp。用篩選出的65條多態(tài)性引物對供試材料分析，共擴增出282個位點，其中多態(tài)性位點150個，多態(tài)性比例為53.19%，每條引物平均擴增出多態(tài)性位點2.31個。通過對ISSR多態(tài)性位點分析，皇后姊妹系和親本材料的Nei基因多樣性指數為0.37，Shannon信息指數為0.55，供試材料具有一定的遺傳多樣性。圖1

圖1 引物890-4(1-12)和891-1(13-24)對12份材料擴增結果
Fig. 1 PCR profile of ISSR-890-4 (1-12) and ISSR-891-1 (13-24) in 12 materials

2.2 姊妹系和親本材料的聚類分析

皇后及其姊妹系和親本材料的JC遺傳相似系數在0.23～0.91，平均值為0.58，表明各份材料間具有一定的異質性，但遺傳距離較近。親本材料金黃與其他供試材料的遺傳相似程度最低，JC相似系數平均為0.28。姊妹系中皇后和皇后88系與其他材料的平均JC相似系數分別為0.51和0.53，皇后85系、皇后86系、青邊皇后和青皮皇后與其他供試材料的遺傳相似度最高，平均JC相似系數大于0.64。供試材料中，親本金黃與皇后88系的遺傳相似度最低(JC值0.23)，而姊妹系皇后86系和皇后88系之間的遺傳相似度最高(JC值0.91)。親本材料金黃與其他供試材料的遺傳差異顯著，除皇后和皇后88系外，皇后姊妹系間的遺傳差異不明顯。表2

表2 供試材料間的Jaccard遺傳相似系數矩陣
Table 2 Data matrix of JC between any pair of materials tested

P1P2P3P4P5P6L1L2L3L4L5L6P11.00P20.541.00P30.670.631.00P40.640.640.661.00P50.660.700.660.771.00P60.270.240.240.300.321.00L10.700.640.760.680.680.301.00L20.690.640.750.660.680.280.911.00L30.530.530.530.500.480.230.670.651.00L40.530.470.520.600.590.320.540.550.401.00L50.630.620.700.590.590.260.790.790.650.491.00L60.660.580.730.630.650.320.780.790.550.540.741.00平均 Average0.58

根據皇后姊妹系和親本材料間的JC遺傳相似系數，利用UPGMA方法進行聚類分析，構建了各供試材料間的遺傳聚類圖。在C相似系數為0.63處將所有材料聚類為4個類群，1個大類群Ⅰ和3個只有一份材料的類群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。

除親本金黃外，所有親本材料和大部分皇后姊妹系被聚在類群Ⅰ內，在相似系數0.66處聚類為2個亞類群Ⅰa和Ⅰb。亞類群Ⅰa包括皇后4個姊妹系(皇后85系、皇后86系、青邊皇后、青皮皇后)和2份親本材料(香梨黃、金棒子)，亞類群Ⅰb包括3份親本材料(黃皮紅肉冬瓜、含笑、紅心脆)。類群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別只有一份材料皇后88系、皇后和親本金黃，與類群Ⅰ內的材料具有一定的遺傳距離。圖2

圖2 供試材料JC聚類
Fig. 2 Dendrogram of materials tested based on JC

2.3 姊妹系和親本材料的主成分

研究表明，第1和第2主成分分別代表了25.0%和14.2%的遺傳變異百分比。分析結果表明，除皇后和皇后88系外其余姊妹系間遺傳差異不明顯，具有聚在一起的趨勢。親本金黃與其余親本材料和皇后姊妹系間遺傳差異顯著，而其余5份親本材料間遺傳差異不明顯。PCA分析結果與UPGMA聚類分析結果一致。圖3

圖3 供試材料ISSR主成分
Fig. 3 Principal component analysis of materials tested based on ISSR

3 討 論

20世紀中期以來，新疆哈密瓜育種經歷了地方品種提純、常規(guī)雜交育種、雜種優(yōu)勢育種和現代生物技術育種等階段，雜種優(yōu)勢育種方法在哈密瓜育種中的應用克服了常規(guī)育種的局限性，而皇后在哈密瓜雜種優(yōu)勢育種研究中發(fā)揮了重要的作用，20世紀90年代中后期培育的一批哈密瓜新品種如86系列、新皇后系列、早皇后系列和抗病皇后系列等，均是直接或間接利用皇后作為親本材料培育出的哈密瓜品種，為推動當時哈密瓜產業(yè)升級奠定了基礎[3]。

植物基因組中含有豐富的SSR即簡單重復序列，SSR標記具有很高的多態(tài)性，在作物高飽和遺傳圖譜研究中得到應用[13]。以5或3端加一個錨定堿基的一段SSR序列(16～20個堿基)為引物進行PCR擴增，可以得到多態(tài)性高、穩(wěn)定、重復性好的ISSR標記[14]。研究利用ISSR標記對皇后姊妹系及其親本材料進行遺傳多樣性分析，結果表明,親本金黃與其余供試材料遺傳差異顯著，而姊妹系中皇后和皇后88系的遺傳基礎較寬。

研究中皇后姊妹系及其親本材料的Shannon信息指數為0.55，低于新疆甜瓜地方品種形態(tài)性狀的Shannon指數值(0.74)[15]，可能原因是研究的親本材料中地方品種數量太少，而且這些地方品種的原產地范圍較狹小。研究中供試材料的Nei基因多樣性指數(0.37)略低于Zhang等[11]的研究(0.42)，而供試材料間的平均JC相似系數與Zhang等[11]的研究均為0.51，可能是由于Zhang等[11]的研究材料中使用了野生甜瓜亞種的緣故。Aierken等[16]利用SSR標記對部分新疆甜瓜地方品種和國外甜瓜資源的核基因組和葉綠體基因組進行遺傳多樣性分析，研究中供試材料的Nei基因多樣性指數(0.24)低于研究(0.37)，可能是兩項研究中使用的標記類型和供試材料的不同而造成。

雜種優(yōu)勢的大小取決于雜交的兩個親本的遺傳差異，理論上兩個親本之間的遺傳差異越大，則出現優(yōu)良后代的幾率也越高[17]。然而，有些研究結果顯示，雜種后代最大的優(yōu)勢并非來自于遺傳差異最大的親本組合，而是來自遺傳距離中等的親本材料組合[18]?；屎蠛突屎?8系與其余供試材料的平均JC相似系數分別為0.51和0.53，呈現出適中的遺傳距離。另外4個姊妹系中，青皮皇后與其余供試材料的平均JC相似系數為0.64，而皇后85系、皇后86系和青邊皇后與其余材料的平均JC相似系數均達0.68，可能是在系譜選育過程中注重個別性狀選擇的結果。農作物育種中，如何科學合理的指導優(yōu)良雜交組合的配制，除應考慮親本的配合力、遺傳力、農藝性狀等其他因素，雙親之間的遺傳差異是關鍵因素，該項研究結果可為哈密瓜雜種優(yōu)勢育種研究和新品種遺傳改良提供指導依據。

4 結 論

4.1 通過對6個皇后姊妹系及其6份選育親本的ISSR遺傳多樣性分析表明，12份材料的Nei基因多樣性指數為0.37，Shannon信息指數為0.55，供試材料具有一定的遺傳多樣性。UPGMA聚類分析和PCA主成分分析結果一致，親本金黃與其他供試材料的遺傳差異顯著，除皇后和皇后88系外，皇后姊妹系間及其與來自新疆的親本材料遺傳差異不明顯。

4.2 國外甜瓜抗源的引進利用，使得皇后和皇后88系的遺傳基礎較寬，并與選育親本間具有一定的遺傳距離，這兩份材料尤其是皇后仍可作為哈密瓜雜種優(yōu)勢育種研究和遺傳改良的骨干親本。