曹曉俊，梅全喜，高玉橋，林慧，胡瑩，彭麗華，成金樂

1.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528401

紅參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，其功能主要為大補(bǔ)元氣，復(fù)脈固脫，益氣攝血，用于體虛欲脫，肢冷脈微，氣不攝血，崩漏下血。紅參破壁飲片為將紅參傳統(tǒng)飲片經(jīng)現(xiàn)代粉碎技術(shù)加工至D90＜45μm（300目以上）的粉體，通過誘發(fā)自身物質(zhì)的黏性，制成的30～100目均勻干燥顆粒狀飲片。其服用方式靈活多樣，可如傳統(tǒng)飲片一樣煎煮服用，也可如沖劑沖泡服用，還可如咖啡制備成混懸液全成分服用。

由于中藥破壁飲片經(jīng)破壁粉碎加工，原傳統(tǒng)飲片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被粉碎破壞，使細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的溶出量大大提高，有利于提高有效成分的利用率，但同時其他成分的加速釋放則可能放大潛在的不良反應(yīng)和毒副作用。另外，與傳統(tǒng)飲片煎煮服用的湯劑相比，中藥破壁飲片的全成分服用方式，造成吸收進(jìn)入人體的化學(xué)成分更充分，也可能產(chǎn)生與傳統(tǒng)飲片不一樣的藥效或毒性反應(yīng)。因此，有必要開展破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的有效性和安全性比較研究，并探索量效關(guān)系和量毒關(guān)系，從而為中藥破壁飲片的安全、臨床有效應(yīng)用提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。本項目以紅參品種為研究對象，以最大給藥量法考察紅參破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的急性毒性差異；以不同劑量的紅參破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的抗疲勞、耐缺氧和耐低溫的藥理藥效差異比較，評價兩種形式飲片的有效性差異[1-3]。

1 材料

1.1 動物

NIH小鼠，體重為20 g～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0002，粵監(jiān)證字2008A022。

1.2 藥品及配制

紅參破壁飲片和紅參傳統(tǒng)飲片（中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；人參莖葉總皂苷片（沈陽東昂制藥有限公司，批號：20090401，每片含人參莖葉皂苷為25 mg）。

藥效試驗藥品配制方法：紅參破壁飲片，加入蒸餾水研磨配制成可灌胃給藥的不同濃度的混懸液；紅參傳統(tǒng)飲片，按照傳統(tǒng)中藥煎煮方法煎煮（加水量為剛好沒過藥面約5 cm，煎煮1.0小時后以紗布過濾藥液，藥渣再加蒸餾水煎煮0.5小時，過濾藥液），濃縮2次濾液成一定濃度的湯劑濃縮液。陽性對照藥（人參莖葉總皂苷片），給藥前將藥片研磨成細(xì)粉狀，并用生理鹽水調(diào)勻成含人參莖葉皂苷29 mg/mL的藥液。

急性毒性試驗藥品配制方法：紅參破壁飲片，加入蒸餾水研磨配制成0.298 g生藥/mL的混懸液（最大質(zhì)量濃度）；紅參傳統(tǒng)飲片，煎煮濃縮成2.27 g生藥/mL的濃縮液（最大質(zhì)量濃度）。

2 方法

2.1 抗疲勞作用比較研究[4-6]

選取NIH小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，均雌雄各半：正常對照組（生理鹽水組）、陽性對照組（人參莖葉皂苷58 mg/kg小鼠）、紅參傳統(tǒng)飲片組（2.34 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片等劑量組（2.34 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/2劑量組（1.17 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/4劑量組（0.59 g生藥/kg小鼠）、紅參破壁飲片1/8劑量組（0.29 g生藥/kg小鼠）。各試藥組動物均按0.1mL/10 g小鼠劑量連續(xù)灌胃給藥7天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥60分鐘后，每只小鼠尾部捆綁相當(dāng)于自身體重10%的重物后將小鼠置于水溫（20±0.5）℃，水深20 cm的恒溫水箱中強(qiáng)制游泳，從小鼠入水時起至沉到水底無力向上沖起時為止記為小鼠持續(xù)游泳時間。

2.2 耐缺氧作用比較研究[5-7]

選取NIH小鼠70只，隨機(jī)分為7組（分組同前），每組10只，均雌雄各半。各試藥組動物均按0.1 mL/10g劑量連續(xù)灌胃給藥3天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥后1小時，將小鼠置于250 mL盛有鈉石灰20 g的磨口廣口瓶內(nèi)，每瓶放1只，于瓶口涂凡士林，將蓋蓋嚴(yán)以造成瓶內(nèi)氧氣逐漸減少，而形成缺氧環(huán)境，密封同時記錄時間，觀察在缺氧應(yīng)激狀態(tài)下小鼠的活動，直至死亡，以呼吸停止為判斷死亡指標(biāo)，記錄各小鼠的存活時間。

2.3 耐低溫作用比較研究[7-8]

選取NIH小鼠140只，隨機(jī)分為7組（分組同前），每組20只，均雌雄各半。各試藥組動物均按0.1 mL/10 g劑量連續(xù)灌胃給藥7天，正常對照組給予等體積生理鹽水。末次給藥30分鐘后，將小鼠放入（-18±1）℃冰箱中，每隔1小時開冰箱檢查1次（出現(xiàn)動物死亡后改為每30分鐘開冰箱檢查1次），拾出死亡動物，記錄3.5小時內(nèi)動物死亡數(shù)，以各組動物的死亡率作為比較指標(biāo)，比較各組小鼠的耐低溫能力。

2.4 急性毒性比較試驗[1-3]

取NIH小鼠90只，雌雄各半，按性別隨機(jī)分為正常對照組、紅參破壁飲片組和紅參傳統(tǒng)飲片組，30只/組（雌雄各半），給藥前禁食不禁水6小時，給藥后禁食4小時。試藥組以最大給藥量法單次灌胃給藥：紅參破壁飲片組按0.032 mL/g最大容積灌胃給予0.298 g生藥/mL的混懸液；紅參傳統(tǒng)飲片組按0.032 mL/g最大容積灌胃給予2.27 g生藥/mL的藥液；對照組按0.04 mL/g給予蒸餾水。灌胃后連續(xù)觀察14天，記錄動物的體重、精神狀態(tài)、毛發(fā)、自主活動、攝食量、糞便、口鼻分泌物等一般狀況，并記錄動物的不良反應(yīng)和死亡情況。實驗結(jié)束時頸椎脫臼處死小鼠，解剖和肉眼觀察重要臟器顏色及形態(tài)學(xué)改變情況。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析及組間t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抗疲勞作用比較

結(jié)果如表1所示：與紅參傳統(tǒng)飲片組相比，等劑量的紅參破壁飲片組動物存活時間顯著延長（P＜0.05），即等給藥劑量下，破壁飲片對小鼠抗疲勞的作用比其傳統(tǒng)飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統(tǒng)飲片比較，其1/2、1/4和1/8劑量的破壁飲片具有同等的抗疲勞作用。

表1 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對小鼠抗疲勞試驗的影響 （±s，n=10）

表1 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對小鼠抗疲勞試驗的影響 （±s，n=10）

注：與紅參傳統(tǒng)飲片組比較，*P＜0.05。

組別正常對照組陽性對照組紅參傳統(tǒng)飲片組紅參破壁飲片等劑量組紅參破壁飲片1/2劑量組紅參破壁飲片1/4劑量組紅參破壁飲片1/8劑量組存活時間（min）2.12±1.32 4.55±2.50 4.56±1.59 7.78±1.58*5.00±1.42 3.54±1.70 3.93±1.92

3.2 耐缺氧作用比較

結(jié)果如表2所示：同等給藥劑量相比，破壁飲片延長小鼠常壓缺氧存活時間的作用比其傳統(tǒng)飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統(tǒng)飲片比較，其1/2、1/4、1/8劑量的破壁飲片均具有同等的提高小鼠耐缺氧作用。

表2 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對小鼠常壓缺氧存活時間的影響 （±s，n=10）

表2 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對小鼠常壓缺氧存活時間的影響 （±s，n=10）

注：與紅參傳統(tǒng)飲片組比較，*P＜0.05

組別正常對照組陽性對照組紅參傳統(tǒng)飲片組紅參破壁飲片等劑量組紅參破壁飲片1/2劑量組紅參破壁飲片1/4劑量組紅參破壁飲片1/8劑量組存活時間（min）29.07±4.06*36.65±3.34 37.12±4.13 43.28±7.89*37.88±4.26 35.99±7.01 37.74±11.30

3.3 耐低溫作用比較

結(jié)果如表3所示：與紅參傳統(tǒng)飲片組相比，等劑量的紅參破壁飲片能顯著降低小鼠死亡率（P＜0.05），即同等給藥劑量下，破壁飲片提高小鼠耐低溫的作用比其傳統(tǒng)飲片更顯著（P＜0.05）；與傳統(tǒng)飲片比較，其1/2劑量的破壁飲片具有同等的藥效作用。

表3 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對小鼠耐低溫作用的影響

3.4 急性毒性比較

與正常對照組比較，紅參破壁飲片組和紅參傳統(tǒng)飲片組動物灌胃給藥后，大部分動物均出現(xiàn)活動減少，神情倦怠，除此以外，未見其他明顯異常反應(yīng)；1～3小時后，動物基本恢復(fù)正常，與正常對照組比較，無明顯異常。3小時后，各組動物的精神狀態(tài)良好、毛色光潔、活動自如、呼吸均勻、攝食量、糞便未見明顯異常、口鼻內(nèi)無異常分泌物，無動物死亡。在給藥前、給藥后第3、第7和第14天，分別對動物進(jìn)行稱重，各時間點動物體重均無明顯組間差異，見表4。

實驗結(jié)束時頸椎脫臼處死小鼠，解剖并肉眼觀察，主要臟器顏色及形態(tài)學(xué)無改變。實驗數(shù)據(jù)顯示，紅參破壁飲片組的小鼠最大給藥劑量為9.5 g生藥/（kg·d），換算成人體用量為1.05 g生藥/（kg·d），紅參傳統(tǒng)飲片的小鼠最大給藥劑量為72.6 g生藥/（kg·d），換算成人體用量為8.0 g生藥/（kg·d），均無急性毒性反應(yīng)產(chǎn)生。紅參傳統(tǒng)飲片的成人（體重60 kg）臨床推薦用量為3.0～9.0 g生藥/d，即成人推薦用量為0.05～0.15 g生藥/（kg·d）。由此可見，以最大給藥量法對小鼠灌胃給藥紅參破壁飲片（劑量相當(dāng)于其傳統(tǒng)飲片臨床用量的7～21倍），未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)。

表4 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片急性毒性實驗觀察結(jié)果 （±s，n=30）

表4 紅參破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片急性毒性實驗觀察結(jié)果 （±s，n=30）

組別正常對照組紅參破壁飲片組紅參傳統(tǒng)飲片組動物數(shù)（n）30 30 30死亡數(shù)（n） 體重/g 0 0 0給藥前21±1.2 21±1.1 20±1.3給藥后3天23.8±2.2 24.6±1.6 22.5±1.4給藥后7天29.9±2.9 30.1±1.3 29.7±1.2給藥后14天37.2±3.2 36.3±1.8 36.5±1.3

4 討論

4.1 研究結(jié)果小結(jié)：綜合紅參破壁飲片與傳統(tǒng)飲片的3個藥效比較研究和急性毒性試驗結(jié)果，表明：①紅參破壁飲片和傳統(tǒng)飲片均有耐缺氧、抗疲勞和耐低溫的作用；②同等劑量下，紅參破壁飲片耐缺氧、抗疲勞和耐低溫的作用比其傳統(tǒng)飲片更顯著；③與傳統(tǒng)飲片比較，其1/2劑量的破壁飲片具有同等的功效作用；④以相當(dāng)于其傳統(tǒng)飲片臨床最大用量的7倍劑量服用紅參破壁飲片時，未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，也未出現(xiàn)毒性反應(yīng)大于其傳統(tǒng)飲片。

4.2 研究樣品制備及給藥方式：本試驗紅參破壁飲片由同批次的傳統(tǒng)飲片制備而成，可減少原料批次差異帶來的試驗誤差，保證試驗的平行可比；紅參破壁飲片的推薦應(yīng)用方式為全成分服用（沖泡連渣服用或制成咖啡狀混懸液服用），而紅參傳統(tǒng)飲片的習(xí)慣應(yīng)用方式為煎煮成湯劑服用，所以為保證試驗的準(zhǔn)確性，本項目在開展藥效和安全性評價試驗時，給受試小鼠服用的樣品也盡量模擬實際應(yīng)用方式而制備（破壁飲片制備成混懸液服用；傳統(tǒng)飲片制備成湯劑服用）。

4.3 劑量的設(shè)置：本試驗在設(shè)置不同劑量的組別時考慮了中藥藥效作用雙向調(diào)節(jié)的特點以及中藥破壁飲片的成分利用率提高對應(yīng)用劑量的影響，所以試驗組除了設(shè)置與傳統(tǒng)飲片的等劑量組以外，還設(shè)置了能反映中藥破壁飲片減少服用劑量的低劑量組別。