王笑顏，紀鵬天，辛少軍，邵圣文

作者單位:313000 浙江湖州，湖州中心醫(yī)院檢驗科免疫室(王笑顏、辛少軍)，腫瘤介入科(紀鵬天)；313000 浙江湖州，湖州師范學院微生物與免疫學教研室(邵圣文)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren's syndrome，pSS) 是一種進展緩慢的自身免疫性疾病，其特征表現為唾液腺和淚腺的進行性破壞，導致唾液和淚液分泌減少，出現口腔黏膜及眼結膜干燥，并可累及肺、腎臟、肝臟以及血管等多個臟器。pSS 是風濕科第二大疾病，患者發(fā)病年齡大多介于40～60 歲，成人患病率為0.5%～1%，女性發(fā)病占90%以上[1-2]。pSS 病因至今不清，目前研究認為病毒、激素、遺傳和環(huán)境因素與pSS 發(fā)病和進展有關[3-4]。pSS 發(fā)病機制主要是由于免疫功能紊亂引起，有報道稱各種細胞因子與自身免疫病密切相關。近年來，微小RNA (microRNA，miRNA) 調節(jié)免疫系統(tǒng)的作用逐漸受到重視，可能與各種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。已有不少文獻報道與pSS 相關的miRNA[5-7]。

本研究通過檢測pSS 患者活動期和穩(wěn)定期miR-146a的相對表達量、細胞因子IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的變化，旨在分析pSS 患者血清miR-146a 與細胞因子的相關性，為miR-146a 參與pSS發(fā)病的機制提供依據，進而為miR-146a 用于診斷pSS 活動期以及監(jiān)測pSS 預后提供依據。

1 對象與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月至2018年9月湖州市中心醫(yī)院風濕免疫科pSS 患者42 例，均為女性住院或?？崎T診患者，年齡為21～63 歲，平均年齡為(40±12) 歲。pSS 患者的病程、血沉(ESR)、C 反應蛋白(CRP)、IgG 抗體、IgA 抗體、IgM 抗體和自身抗體等相關數據及疾病的受累情況見表1。依據干燥綜合征疾病活動指數 (SSDAI) 對pSS組患者進行篩查，分為pSS 活動期組(SSDAI≥5分) 20 例，pSS 穩(wěn)定期組(SSDAI＜5 分) 22 例。符合2002年美國-歐洲分類診斷標準(American-European Consensus Criteria，AECC)[8-9]。診斷標準:(1) 口干癥狀；(2) 眼干癥狀；(3) 口干體征，方糖試驗30 min 內未融化；(4) 眼干體征，施墨試驗≤5 mm/5 min；(5) 唇腺活檢至少有1 個淋巴細胞浸潤灶；(6) 血清學檢查，類風濕因子、抗SS-A、抗SS-B 抗體至少有1 項為陽性；(7) 無類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等其他自身免疫性疾病。初診組患者為以上6 項中(5)、(6) 均為陽性，而其余4 項中至少2 項為陽性。pSS 患者的選擇依據不并發(fā)其他自身免疫性疾病，遺傳性疾病，口眼客觀檢查有干燥現象，排除其他可以引起口眼干燥的情況。且下唇腺活檢顯示所有患者均存在腺體萎縮及灶性淋巴細胞浸潤。另選擇本院同期體檢的40 例健康女性志愿者為正常對照組，年齡為20 ～65 歲，平均年齡為(42.5±14) 歲。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑:人Plasma/Serum RNA Purification Mini Kit (Cat.55000) (加 拿 大Norgen 公 司)，miRNA 反轉錄試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 試劑盒等(開源基因公司)，miR-146a 引物(開源基因公司)，IL-17 試劑盒(北京華英生物技術研究所公司)。IL-6 和TNF-α 試劑盒(北京東雅生物技術研究所)。

1.2.2 儀器:ABIPRISM? 7900HT 型熒光定量PCR 儀，Uranus AE150 全自動酶免儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:每例患者和健康對照者采集外周靜脈血4 mL 至凝膠分離試管，3 500 r/min 離心15 min取上清，采用總RNA 提取試劑盒提取總RNA，-70 ℃保存。

1.3.2 實時熒光定量PCR (qPCR) 檢測miR-146a:取健康對照組和pSS 患者組總RNA 進行逆轉錄，以U6 作為內參照。逆轉錄反應體系為10 μl，總RNA 樣品量為5 μl，加入隨機引物和逆轉錄酶，反應后得到cDNA。qPCR 反應進行40 個循環(huán):95 ℃10 s，60 ℃20 s，70 ℃10 s。qPCR 反應體系:熒光染料9 μl、cDNA 模板2 μl、正鏈引物2 μl、反鏈引物2 μl、加水至總體積20 μl，復孔為3 個。ABI 7500RT-PCR 儀檢測，數據采用2-△△Ct法分析。

1.3.3 血清IL-17、IL-6、TNF-α 測定:無菌抽取外周靜脈血4 ml 加入含有凝膠的試管，于留取標本后30 min 內，3 500 r/min離心15 min 用移液器將上清移入1 ml的EP 管中，-20 ℃冰箱中凍存待用。按試劑說明書要求，采用ELISA 酶聯免疫法檢測。

1.3.4 活動期和穩(wěn)定期pSS 患者miR-146a 相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α 的相關性分析:采用Pearson 相關性和回歸分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，miR-146a定量檢測結果換算成2-ΔCt，用相對表達量表示。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗法作數據正態(tài)性檢驗，對于符合正態(tài)分布的數據，兩組間均值差異比較采用t檢驗，配對組間均值差異比較采用t檢驗。pSS 患者穩(wěn)定組和活動組miR-146a 的含量與IL-17、IL-6 和TNF-α 的相關性分析采用Pearson 相關性分析，采用一元線性回歸法對miR-146a 相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α 水平進行回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組pSS 患者一般資料比較

pSS 活動組和穩(wěn)定組比較，病程較長 (P＜0.163)，ESR 快(P＜0.05)，CRP 炎癥指標偏高(P＜0.05)，活動組口干、猖獗齒、關節(jié)炎和腮腺腫大均較穩(wěn)定組受累人數多(P＜0.05)，可能與疾病活動有關，差異有統(tǒng)計學意義。其余指標兩組間差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 pSS 穩(wěn)定組、pSS 活動組和對照組miR-146a相對表達量及血清細胞因子含量比較

pSS 活動組血清miR-146 a 的相對表達量、IL-17、IL-6 和TNF-α 的含量均高于穩(wěn)定組和對照組(P＜0.05)；pSS 穩(wěn)定組各指標的表達量高于對照組(P＜0.05) (表2)。

2.3 pSS 患者穩(wěn)定組和活動組miR-146a 相對表達量與血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的相關性分析

pSS 患者穩(wěn)定組和活動組miR-146a 的表達水平與IL-17、IL-6 和TNF-α 含量均呈正相關(r＝0.720、0.798、0.644，P＜0.001)。

表1 pSS 穩(wěn)定組患者和pSS 活動組患者的一般資料Table 1 General materials of stable group and active group of pSS

表2 pSS 穩(wěn)定組和活動組與健康對照組miR-146a 相對表達量及血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量比較(±s)Table 2 Comparison of expression of the relative miR-146a and serum IL-17，IL-6，and TNF-α level in and active pSS stable and healthy control group ( ±s)

表2 pSS 穩(wěn)定組和活動組與健康對照組miR-146a 相對表達量及血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量比較(±s)Table 2 Comparison of expression of the relative miR-146a and serum IL-17，IL-6，and TNF-α level in and active pSS stable and healthy control group ( ±s)

*穩(wěn)定組vs 對照組P＜0.05；**活動組vs 對照組P＜0.05；△活動組vs 穩(wěn)定組P＜0.05

組別 例數 miR-146a IL-17 (μg/L) IL-6 (μg/L) TNF-α (μg/L)對照組 40 5.24±0.88 49.05±8.55 44.22±10.78 80.76±16.33穩(wěn)定組 22 18.63±7.07* 96.47±19.92* 93.16±12.56* 151.37±38.55*活動組 20 44.71±18.39**△ 128.14±13.60**△ 128.19±13.09**△ 172.19±34.31**△

2.4 miR-146a 相對表達量與血清IL-17、IL-6 和TNF-α 含量的一元線性回歸分析

以miR-146a 為自變量，以IL-17、IL-6 和TNF-α含量為因變量，進行一元線性回歸分析，結果顯示miR-146a 相對表達量越高，IL-17、IL-6 和TNF-α含量也越高(P＜0.05) (表3)。

表3 miR-146a 相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α含量的一元線性回歸分析Table 3 Univariate linear regression analysis of the relative expression of miR-146a and the contents of IL-17，IL-6，and TNF-α

3 討論

干燥綜合征是一種主要累及淚腺和唾液腺等外分泌腺的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，表現為淚腺和唾液腺的進行性破壞，導致淚腺和唾液腺分泌減少，導致口腔黏膜和眼結膜干燥。病變局限在淚腺和唾液腺，則稱為原發(fā)性pSS，伴有其他自身免疫病則稱為繼發(fā)性SS。SS 患者男女之比1 ∶9。目前發(fā)病機制還不明確，可能與免疫、病毒、遺傳、激素等因素有關。近些年miRNA 和免疫相關因子的異常表達在這些因素中所起的作用越來越受到關注。

本研究發(fā)現，pSS 穩(wěn)定組和活動組患者血清miR-146a 相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α 含量均明顯高于對照組(P＜0.05)，提示miR-146a、IL-17、IL-6 和TNF-α 都可能參與了pSS 疾病的發(fā)生發(fā)展。Pauley 等[10]研究發(fā)現，在8 和20 周自發(fā)干燥綜合征小鼠外周單核細胞中，miR-146a 的表達均顯著升高。研究顯示SS 患者外周血miR-146a與對照組相比提高了7.9 倍。以上的表達差異是診斷性miRNA 探針研發(fā)的理論基礎，SS 在細胞免疫方面的研究罕見報道。Zilahi 等[11]研究發(fā)現，SS患者與健康對照組相比，PBMCs 中miR-146a 及其靶基因TRAF6 過度表達，而另一靶基因IRAK1 的表達顯著下降。本試驗pSS 患者組miR-146a 表達量升高的結論與 Pauley 和 Zilahi 研究一致。Taganov 等[12]研究發(fā)現，pSS 患者miR-146a 的靶基因是IRAK-1 和TRAF-6，這兩種炎癥反應中重要的信號分子由TLR7 (TOLL-like receptor 7) 和TLR9(TOLL-like receptor 9) 所介導，這兩個基因經常被認為是炎癥信號途徑中的重要靶基因。激活信號途徑中的TLR 和其配體MyD88 (myeloid differentiation factor 88) 能夠引起IRAK 磷酸化，并激活TRAF-6，形成MyD88-IRAK1-TRAF6 復合體，這條通路能夠激活JNK 和NF-κB 信號通路，而NF-κB信號通路能夠調整TNF-α 和IL-1β[13].在TLR 激活NF-κB 信號通路的同時，TRAF6 也介導了MyD88依賴和非依賴信號通路，通過TRAF6 介導，調節(jié)下游信號通路，進而調節(jié)TNF-α 的分泌。但miR-146a 的升高為何不能很好地抑制過度的免疫炎癥反應，有學者認為miR-146a 與靶基因結合后功能缺陷，導致其不能發(fā)揮抑制免疫炎癥的作用，使體內TNF-α 表達持續(xù)升高。

CD4＋表達的Th17 細胞在pSS 中發(fā)揮重要作用[14]，通過分泌IL-17、IL-6 等細胞因子，加劇促炎癥反應，長期的慢性炎癥反應導致患者外分泌腺大面積受累，出現口干、眼干以及腺體腫脹等臨床癥狀。研究發(fā)現，IL-17 是唾液腺功能受損的重要炎癥因子[15]。Ciccia 等[16]發(fā)現，在pSS 患者炎癥浸潤的唾液腺中，IL-17、IL-22、IL-23 及其mRNA水平明顯上調，信號轉導子和轉錄激活子3 mRNA與絡氨酸磷酸化相關蛋白水平在pSS 患者體內也明顯上調，表明IL-17 和miR-146a 可能在pSS 的促炎癥反應過程中發(fā)揮關鍵性作用。Lin 等[17]發(fā)現在一些野生型小鼠體內注射Th17 細胞后，小鼠出現了與pSS 相似的臨床癥狀。以上研究充分證明了IL-17對pSS 的發(fā)病有一定的促進作用。

同時研究發(fā)現IL-6 是反映機體炎癥和組織損傷嚴重程度的重要標志物。本研究發(fā)現pSS 活動期組IL-6 含量比對照組高，說明IL-6 參與了疾病的發(fā)生，IL-6 的升高預示著pSS 患者的疾病預后不良。Roescher 等[18]研究發(fā)現TNF-α、IL-1β 高表達于干燥綜合征患者和實驗動物外周血及頜下腺中。研究者分析TNF-α 不但調控多種細胞因子的分泌，促進B、T 淋巴細胞產生抗體，引起炎癥反應，還可單獨與IFN-γ 一起誘導細胞凋亡，引起唾液腺細胞分泌障礙，因此TNF-α 可能是pSS 一個關鍵的致病細胞因子。

本研究中pSS 活動組的miR-146a、IL-17、IL-6和TNF-α 表達量與pSS 穩(wěn)定組和對照組比較明顯增高(P＜0.05)，pSS 穩(wěn)定組和對照組比較亦增高明顯(P＜0.05)，且miR-146a 的相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α 含量有明顯相關性，進一步證實pSS 與TNF-α 等細胞因子異常密切相關。TNF-α 的表達增多對pSS 的發(fā)生發(fā)展有著重要影響，并與其疾病活動性密切相關[19]，本研究結果與其一致。

本研究顯示miR-146a 的相對表達量與IL-17、IL-6 和TNF-α 呈正相關，回歸分析結果顯示miR-146a 水平越高，IL-17、IL-6 和TNF-α 水平也越高(P＜0.05)，提示miR-146a 表達量可預測IL-17、IL-6 和TNF-α 水平，進一步說明它們之間存在著某種依賴性。miR-146a 是天然免疫和獲得性免疫的重要調控因子[20]，其機制可能是miR-146a 的過表達激活了靶基因TRAF-6，促使TNF-α 分泌增加；miR-146a 的含量增加促使Th17 細胞激活，從而導致IL-17、IL-6 分泌增多，引起全身自身免疫反應；也可能是miR-146a 與IL-17 和IL-6 及TNF-α共同作用于pSS 患者促使疾病的發(fā)生發(fā)展。