何 成,王 酉,李 光,周武杰

(1.浙江科技學(xué)院信息與電子工程學(xué)院,杭州 310023;2.浙江大學(xué)控制科學(xué)與工程學(xué)院,杭州 310027)

人類的情感是豐富多彩的,在處于不同的天氣、環(huán)境和場景時,情感也會隨之發(fā)生改變,而這些情感的變化都與腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)有著密切的關(guān)系。

多巴胺(Dopamine)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),能使人感到興奮愉悅,還有助于提高記憶力[1]。如果腦內(nèi)的多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂,就會引起相關(guān)的神經(jīng)疾病,比如精神分裂癥、帕金森癥等[2]。目前,多巴胺在體內(nèi)的作用機理以及病癥原因還未有統(tǒng)一確切的解釋。其中的一個主要原因是仍然缺乏十分有效的檢測手段,尤其是腦內(nèi)多巴胺含量的動態(tài)監(jiān)測。

目前,用于多巴胺的檢測方法主要有高效液相色譜法[3-4]、熒光標(biāo)記法[5-6]、核磁共振波譜法[7]和電化學(xué)法[8-10]等。相較于譜學(xué)分析方法,電化學(xué)法不需要昂貴的設(shè)備、復(fù)雜的預(yù)處理過程,具有靈敏度高,響應(yīng)速度快等特點。在電化學(xué)法中,通常以電流作為特征信號來檢測多巴胺的含量[11],此類電流型傳感器在檢測時需要外加電壓,在活體檢測中會影響周圍神經(jīng)細(xì)胞的正常生理活動,且在檢測過程中會不斷消耗多巴胺[12]。由于多巴胺在酸性環(huán)境中具有質(zhì)子化的特點,也可以采用電壓型傳感器進行檢測。離子選擇性電極是其中最具代表性的一類,此類電極在檢測時不需要外加電壓,可以減少對被測液的影響。此外,由于離子選擇性電極良好的動態(tài)響應(yīng)特性,適用于檢測神經(jīng)系統(tǒng)中濃度變化迅速的多巴胺。目前利用電壓型傳感器檢測多巴胺含量的研究并不多,較有代表性的是Othman A M等人制作的傳統(tǒng)多巴胺離子選擇性電極,將冠醚衍生物作為對多巴胺敏感的離子載體[13]。

傳統(tǒng)的離子選擇性電極中含有內(nèi)充電解液,當(dāng)敏感膜內(nèi)外的待測離子濃度不同時,待測離子會互相滲透,改變原溶液濃度,影響測量結(jié)果。此外,由于內(nèi)充液的存在,在長時間使用或保存時,內(nèi)充液會逐漸流失使測量產(chǎn)生偏差[14]。為了克服內(nèi)充電解液帶來的不足,將傳統(tǒng)的內(nèi)充液用固態(tài)電解質(zhì)代替,實現(xiàn)電極的全固態(tài)化。固態(tài)化后的電極能夠降低檢測下限,具有體積小,免維護,操作簡單,使用壽命長等特點。固態(tài)電解質(zhì)在電極中的主要功能是實現(xiàn)離子-電子的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)電聚合物則具備了良好的轉(zhuǎn)換能力。導(dǎo)電聚合物的種類很多,其中用聚(苯乙烯磺酸鈉)摻雜的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT/PSS)能夠維持電位長時間穩(wěn)定,且具有對O2和CO2(pH)不敏感的特性,是一種理想的固態(tài)電解質(zhì)材料[15-16]。

本文提出了一種全新的基于全固態(tài)離子選擇性電極的多巴胺生物傳感器。在金盤電極表面涂覆PEDOT/PSS作為固態(tài)電解質(zhì),在骨架材料高分子聚氯乙烯(PVC)中添加離子載體CE-TPB和增塑劑2-硝基苯辛醚(NPOE)合成多巴胺敏感膜,將其固定在固態(tài)電解質(zhì)表面。制備的全固態(tài)多巴胺離子選擇性電極具有操作簡單,檢測下限低,反應(yīng)靈敏,使用壽命長等特點。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與實驗儀器

12-冠醚-4,四苯硼鈉,2-硝基苯辛醚(NPOE),高分子聚氯乙烯,氯化乙酰膽堿,多巴胺鹽酸鹽,抗壞血酸,尿素均購自Sigma-Aldrich公司。四氫呋喃,氯化鈉,氯化鉀,氯化鈣,醋酸,醋酸鈉,氫氧化鈉,苯酚,曲拉通均采購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。茶多酚購買于江蘇德和生物科技有限公司。人工腦脊液購買于北京雷根生物技術(shù)有限公司。聚(3,4乙撐二氧噻吩)/聚(苯乙烯磺酸酯)水分散液購買于德國H.C.Starck公司。42號Whatman定量濾紙購自上海必泰生物科技有限公司。所有實驗均采用去離子水,由美國Milli-Q凈水系統(tǒng)制造。電極檢測實驗通過CHI660E電化學(xué)工作站實現(xiàn),通過配套軟件實時檢測和顯示電極電壓的變化,該工作站購買自上海辰華儀器有限公司。Ag/AgCl參比電極和金盤電極均采購于天津艾達(dá)恒晟科技有限公司。pH計購買于Mettler-Toledo股份有限公司。電子天平購自德國Sartorius Intec公司。

1.2 離子載體CE-TPB制備

用于制備多巴胺敏感膜的離子載體在市場上沒有銷售,需要在實驗室合成。分別量取相同體積的濃度均為0.01 mol/L的12-冠醚-4溶液和四苯硼鈉溶液,倒入同一燒杯中進行電磁攪拌。將混合均勻的渾濁液倒入濾紙中過濾,并用少量去離子水清洗,將濾紙放入干燥箱中常溫干燥24 h,再將濾紙上的白色粉末取下并研磨均勻。存儲備用的白色粉末即為用12-冠醚-4和四苯硼鈉合成的離子載體CE-TPB。制備的CE-TPB的空穴結(jié)構(gòu)對被測陽離子的大小很敏感,而質(zhì)子化的多巴胺能夠很好地與該離子載體的空穴相匹配[13]。

圖1 多巴胺傳感器

1.3 全固態(tài)多巴胺生物傳感器制備

首先配制多巴胺敏感膜液,在四氫呋喃中加入一定比例的骨架材料PVC粉末、增塑劑2-硝基苯辛醚和離子載體CE-TPB,其中PVC與四氫呋喃的比例為1:10(mg/μL)。將配制的混合溶液連續(xù)振蕩,直到變?yōu)槌吻逋该鞯恼吵砣芤??；旌暇鶆虻亩喟桶访舾心ひ好芊獗４嬖? ℃的冰箱中。

然后在PEDOT/PSS分散液中添加1‰的曲拉通,使其具有更好的擴散性和粘度。將混合均勻的分散液點涂到金盤電極表面,優(yōu)化后的點涂量為1.5 μL,在干燥箱中放置24 h,形成光滑致密的導(dǎo)電聚合物層。最后在導(dǎo)電聚合物層上點涂4.0 μL多巴胺敏感膜液[15,17],放入干燥箱中干燥24 h,形成光滑透明的PVC膜。制備的全固態(tài)多巴胺生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖和實物圖如圖1所示。

1.4 多巴胺檢測實驗

在多巴胺傳感器使用之前,先將傳感器浸入去離子水中進行活化,使電壓值穩(wěn)定。多巴胺檢測實驗采用兩電極體系,即采集多巴胺傳感器與Ag/AgCl參比電極的電勢差作為檢測信號,通過電化學(xué)工作站及配套軟件實時記錄電壓的變化。所有實驗均在室溫25 ℃下進行,每次檢測持續(xù)60 s,并將60 s時的電壓值作為檢測結(jié)果。此外,由于多巴胺見光容易分解的特性,每次實驗前均會配制新鮮的多巴胺醋酸/醋酸鈉緩沖液。實驗結(jié)束后,用去離子水清洗多巴胺傳感器,放入干燥箱中保存。

1.5 多巴胺敏感膜配方優(yōu)化

多巴胺敏感膜配比的不同會直接影響傳感器的性能。在制備敏感膜時,固定敏感膜骨架材料PVC和增塑劑NPOE的比例不變,約為2∶1[18],改變CE-TPB的含量,測定不同配比下傳感器的斜率、檢測下限和線性度,具體比例如表1所示。從表中可以看出,CE-TPB含量在1.0%～3.0%之間時,隨著含量的增加,傳感器的性能得到了一定的提升,其中CE-TPB含量為3.0%時,性能最佳。之后再繼續(xù)增加含量,傳感器性能基本維持現(xiàn)狀甚至出現(xiàn)下降。因此,將敏感膜配方確定為32.3%的PVC,64.7%的NPOE和3.0%的CE-TPB。

表1 不同配比下多巴胺敏感膜的傳感器性能

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍與檢測下限

配制11個多巴胺濃度從10-7mol/L到10-2mol/L的多巴胺醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH=7.0)。按濃度從低到高的順序依次檢測,重復(fù)檢測3次,檢測結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出,傳感器的線性范圍為10-5mol/L～10-2mol/L,斜率為(52.09±0.38)mV/decade,與能斯特方程的理論斜率59.16 mV/decade相接近。根據(jù)IUPAC的計算方法,可得傳感器的檢測下限為(7.69±0.77)μmol/L。

圖2 多巴胺傳感器校準(zhǔn)曲線

2.2 選擇性系數(shù)

為檢測研制的多巴胺傳感器的抗干擾性能,選取組織液或血液中常見的Na+、K+、Ca2+、乙酰膽堿(ACh)、抗壞血酸(AA)、尿素(Ur)以及多巴胺類似物苯酚(PH)、茶多酚(TP)作為干擾離子。根據(jù)固定干擾離子法[19],分別計算多巴胺傳感器對不同干擾離子的選擇性系數(shù),干擾離子的濃度和實驗結(jié)果如表2所示。干擾系數(shù)的對數(shù)越小表示抗干擾能力越強。從表中可以看出,多巴胺傳感器對多巴胺的結(jié)合能力強于干擾離子約100倍,說明該傳感器具有良好的選擇性。

表2 多巴胺傳感器選擇性系數(shù)

2.3 pH的影響

多巴胺在不同的pH下化學(xué)特性會發(fā)生變化,在酸性條件中多巴胺具有質(zhì)子化的特點,而在堿性環(huán)境中多巴胺會發(fā)生自聚合現(xiàn)象生成聚二甲基?？疾觳煌瑵舛炔煌琾H下,傳感器對多巴胺的響應(yīng)特性,如圖3所示。由圖可知,同一pH不同濃度時,多巴胺傳感器具有良好的線性響應(yīng)特性。在同一濃度時,pH在6.0～7.0的范圍內(nèi)傳感器電壓基本保持不變,當(dāng)pH大于7.0時,檢測電壓隨著pH的增加出現(xiàn)下降的趨勢,表明緩沖液中質(zhì)子化的多巴胺離子減少,符合堿性條件下多巴胺易聚合的特征[20]。由此表明,在pH為弱酸或中性環(huán)境下傳感器的檢測效果最佳。

圖3 不同pH下多巴胺傳感器的檢測結(jié)果

2.4 動態(tài)響應(yīng)特性

考察加入不同濃度的多巴胺后,傳感器的動態(tài)響應(yīng)特性,如圖4所示。圖中箭頭表示在該時刻加入一定量的高濃度多巴胺溶液,整個檢測過程用磁力攪拌器攪拌(速率為400 rpm)。從圖中可以看出,多巴胺濃度從10-7mol/L～10-3mol/L的增長過程中,傳感器均能迅速響應(yīng)并馬上達(dá)到穩(wěn)定,表明該傳感器能夠?qū)崟r檢測多巴胺大范圍的快速變化。這一特性符合神經(jīng)信號傳遞時,神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺濃度變化范圍廣、速度快的特點,為之后研制適用于在體檢測的微型多巴胺傳感器提供了新的思路和方法。

根據(jù)動態(tài)響應(yīng)曲線繪制多巴胺傳感器的校準(zhǔn)曲線,如圖5所示。由圖可得,傳感器線性范圍為10-5mol/L～10-3mol/L,斜率為53.51 mV/decade,檢測下限達(dá)到1.82 μmol/L。與靜態(tài)環(huán)境下測得的傳感器性能相比均有了一定程度的提升,究其原因可能是通過磁力攪拌增強了緩沖液的多巴胺活性,且與傳感器表面有了更好的結(jié)合,從而降低了檢測下限,提高了斜率[21]。

依次加入一定量高濃度多巴胺溶液使緩沖液濃度變?yōu)棰?0-7 mol/L;②3×10-7 mol/L;③10-6 mol/L;④3×10-6 mol/L;⑤10-5 mol/L;⑥3×10-5 mol/L;⑦10-4 mol/L;⑧3×10-4 mol/L;⑨10-3 mol/L圖4 多巴胺傳感器動態(tài)響應(yīng)曲線

圖5 多巴胺傳感器動態(tài)響應(yīng)校準(zhǔn)曲線

2.5 一致性與重復(fù)性

選用同一批次的3個多巴胺傳感器檢測同一濃度的多巴胺緩沖液,測試傳感器的一致性;采用同一個傳感器檢測3個不同濃度的多巴胺緩沖液,每個緩沖液測3次,檢測結(jié)果如表3所示。從表中可以看出,3個傳感器對同一個濃度的檢測結(jié)果保持基本一致,且與標(biāo)定值相接近,說明制作的多巴胺傳感器具有良好的一致性;同一傳感器多次測量同一濃度所得檢測結(jié)果與標(biāo)稱值接近,且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi),表明該傳感器具有良好的重復(fù)性。

表3 多巴胺傳感器一致性和重復(fù)性

2.6 使用壽命

檢測多巴胺傳感器的使用壽命,采用同一個新制的傳感器每隔若干天檢測多個濃度的多巴胺緩沖液,將傳感器斜率作為評價指標(biāo)。圖6表示傳感器一個月內(nèi)斜率的變化情況?？梢钥闯?傳感器斜率接近能斯特方程的理論值,在3.00 mV/decade的范圍內(nèi)波動,基本保持穩(wěn)定,說明該傳感器在一個月內(nèi)能夠正常使用。

圖6 多巴胺傳感器使用壽命

2.7 人工腦脊液中的多巴胺檢測

將人工腦脊液作為背景溶液,檢測多巴胺傳感器的線性范圍和檢測下限。向人工腦脊液分別加入一定量的高濃度多巴胺溶液,配制成11個濃度從10-7mol/L到10-2mol/L的多巴胺溶液。按濃度從低到高的順序依次檢測,重復(fù)檢測3次,檢測結(jié)果如圖7所示。

圖7 人工腦脊液中的多巴胺傳感器校準(zhǔn)曲線

從圖7中可以看出,傳感器的檢測下限為(1.80±0.65)μmol/L,線性范圍為10-5mol/L～3×10-3mol/L,斜率為(43.23±0.65)mV/decade,與在醋酸/醋酸鈉緩沖液中測得的斜率相比有一定程度的下降,可能的原因為人工腦脊液pH為7.1,呈弱堿性,影響了多巴胺的質(zhì)子化,造成斜率降低。此外,人工腦脊液是一種復(fù)雜的混合溶液,包含鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子、氯離子、碳酸氫根、磷酸二氫根和葡萄糖等多種成分,且濃度相對較高。在檢測過程中,這些成分尤其是陽離子,部分聚集到了敏感膜表面,對多巴胺傳感器造成干擾。后續(xù)可以嘗試合成新的多巴胺離子載體進一步提高傳感器的抗干擾性。

3 結(jié)論

本文研制了一種全新的全固態(tài)多巴胺生物傳感器。以金盤電極作為傳感器主體,將PEDOT/PSS作為固態(tài)電解質(zhì)實現(xiàn)離子-電子的轉(zhuǎn)換功能,最后通過多巴胺敏感膜特異性結(jié)合溶液中的多巴胺進行檢測。所研制的傳感器對多巴胺有極快的響應(yīng)速度,且具有較低的檢測下限,較寬的線性范圍,較長的使用壽命,良好的重復(fù)性、一致性和抗干擾能力。本研究提出的電壓型非酶全固態(tài)多巴胺生物傳感器為在體神經(jīng)遞質(zhì)的實時檢測提供了新的檢測思路。