王志碩, 王 琨, 毛紅菊

(1.中國科學院 上海微系統(tǒng)與信息技術研究所，上海 200050； 2.中國科學院大學，北京 100049)

0 引 言

外泌體是一種直徑在30～150 nm之間的囊泡結(jié)構(gòu)，由大部分細胞分泌到體液中，攜帶有宿主細胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、線粒體DNA等物質(zhì)，在細胞間通信發(fā)揮著重要作用[1～5]。腫瘤來源的外泌體積極參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程，其作為腫瘤標志物的潛力得到越來越多的重視[6]。然而，由于外泌體復雜的生物起源和納米(nm)級的微小尺寸，其分離/檢測方法受到嚴重限制，阻礙了相關研究的進一步發(fā)展。超速離心是當前應用最為廣泛的外泌體分離方法[7]，也被視作外泌體分離的金標準，包括一系列轉(zhuǎn)速逐漸升高的離心操作。然而由于其存在操作耗時長、依賴昂貴的儀器、樣本需求量大等缺陷，發(fā)展快速簡便、經(jīng)濟適用的外泌體分離方法成為必然趨勢。

微流控芯片技術是一種在微米(μm)尺度上操控流體或者其中微粒的科學技術，將生物、化學等實驗室的基本功能集成到一塊幾平方厘米大小的芯片上，又被稱為芯片實驗室[8～10]。微流控芯片具有體積小、反應迅速和成本低等優(yōu)點[11,12]，在外泌體分離/檢測上表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，近年來出現(xiàn)多種利用微流控芯片技術分離/檢測外泌體的芯片[13]。來自堪薩斯大學的研究人員在2014年開發(fā)出一種集成微流控芯片[14]，通過CD63標記的磁性微球捕獲外泌體，對捕獲到的外泌體裂解之后檢測其內(nèi)容物。在2016年開發(fā)了一種ExoSearch芯片[15]，通過CD9標記的磁性微球捕獲外泌體，對其表面標記物進行檢測。然而磁性微球的團聚容易造成不同微球表面熒光信號的互相干擾，影響檢測結(jié)果的觀察與檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析。

為了解決磁性微球團聚造成熒光信號干擾的問題，本文報道了一種可以使微球在芯片內(nèi)均勻排布的微流控芯片。一方面，使用微球代替磁性微球作為捕獲載體，使得芯片無需外加磁場驅(qū)動，簡化了進樣流程，減少了人工操作；另一方面，通過微球在芯片內(nèi)的均勻排布，解決了微球的團聚堆積問題，避免了不同微球間熒光信號的干擾，可以觀察到更精確的信號，提高了檢測結(jié)果的精度與檢測的靈敏度。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與設備

LC100A正性光刻膠購買自Micro Chem(加拿大)；聚二甲基硅氧烷(PDMS)購買自Dow Corning(美國)；磷酸鹽緩沖液(PBS)購買自生工生物(上海)；直徑15 μm的羧基聚苯乙烯微球購買自倍思樂(天津)；用于微球活化的碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購買自Sigma Aldrich(美國)；CD9抗體購買自Ancell(美國)；癌胚抗原(CEA)抗體購買自Medix Biochemica(芬蘭)，并由珈源量子點(武漢)制備成紅色量子點探針(激發(fā)波長：490 nm，發(fā)射波長：625 nm)；A549細胞系購買自中國科學院細胞庫，在含10 %胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，F(xiàn)BS和RPMI 1640培養(yǎng)基均購買自賽默飛(美國)。

硅片光刻在Karl Suss的接觸式光刻機MA6B(德國)中進行；深反應離子刻蝕在英國STS(Surface Technology Systems plc)的離子刻蝕機中進行；硅片的掃描電鏡圖(scanning electron microscope,SEM)由場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-7800F，JEOL，日本)在10.0 kV的加速電壓下拍攝得到；對PDMS和玻璃片的等離子體處理在銘恒科技(成都)的等離子清洗儀器內(nèi)進行；超速離心收集外泌體在Beckman Coulter(美國)的L—90K超速離心機中進行；外泌體的濃度通過Particle Metrix(德國)的ZetaView儀器利用納米粒子追蹤技術(NTA)測量得到；芯片進樣在Havard Apparatus(美國)的注射泵PHD 22/2000下進行；在Olympus(日本)的顯微鏡IX51、CCD相機DP80下進行明場和熒光觀察。

1.2 芯片的制作

用于微球均勻排布的微陣列芯片的制作工藝流程如圖1所示，首先在4寸的硅片上旋涂1.7 μm厚的LC100A正性光刻膠，110 ℃前烘90 s，然后在紫外燈下曝光，曝光時間為4.5 s，曝光后的硅片顯影45 s，清洗干凈之后135 ℃后烘30 min(如圖1(a)～(c)所示)；然后通過深反應離子刻蝕技術(deep reactive ion etching,DRIE)對光刻后的硅片進行刻蝕，刻蝕深度為20 μm，刻蝕之后對硅片表面殘余的光刻膠進行去膠操作(如圖1(d)～(e)所示)；將PDMS基體與固化劑按10︰1的比例混合均勻，真空處理后涂布在刻蝕后的硅片表面，95 ℃加熱1 h使PDMS固化，將固化后的PDMS從硅片上揭下并與玻璃片一起經(jīng)過等離子體處理，鍵合形成PDMS芯片(如圖1(f)～(h)所示)。

圖1 芯片制作的工藝流程

1.3 標準外泌體樣品的準備

標準外泌體樣品通過低溫超速離心的方法從A549細胞系的培養(yǎng)上清液中收集，整個收集步驟包括一系列的梯度離心操作，所有的離心步驟均在4 ℃下進行[16]。

1)對收集的細胞培養(yǎng)上清液以300×1gn的速度離心10 min，收集上清液，以便去除細胞上清液中可能殘留的細胞；

2)對上一步得到的上清液以2 000×1gn的速度離心10 min，收集上清液，以便去除可能殘留的死細胞；

3)對上一步得到的上清液以10 000×1gn的速度離心30 min，收集上清液，以便去除可能殘留的細胞碎片；

4)對上一步得到的上清液以100 000×1gn的速度離心70 min，去除上清液，留下試管底部的沉淀，沉淀包含有外泌體和雜蛋白。

5)將上一步得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，再以100 000×1gn的速度離心70 min，去除上清液，留下試管底部的沉淀，這時的沉淀主要就是外泌體。用150 μL PBS重懸得到的沉淀，儲存在4 ℃以供使用，或者在-80 ℃長期保存。

最終利用納米粒子跟蹤技術(nanoparticle tracking technology,NTA)對超速離心得到的外泌體標準樣品進行了測定，測定結(jié)果顯示外泌體標準樣本的濃度為5×107個/mL。

1.4 微球的活化與抗體標記

羧基聚苯乙烯微球在EDC和NHS的作用下激活表面的羧基，激活后的羧基與CD9抗體偶聯(lián)用于捕獲外泌體[17]。在微球上標記抗體的具體步驟如下：

1)微球清洗：取10 μL微球原液與90 μL PBS混合，充分混勻，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液，留下底部沉淀的微球，以便在于清洗微球；

2)微球活化溶液配置：使用pH值為5的酸性PBS配置10 mg/mL的NHS和EDC溶液，用于微球活化；

3)微球活化：往微球內(nèi)加入80 μL pH值為5的PBS，再加入配置好的NHS和EDC溶液各10 μL，充分混勻，放置在恒溫混勻儀上(25 ℃，300 r/min，1 h)，每隔20 min將試管取出并振蕩，以防微球沉淀；

4)抗體標記：將活化好的微球以6 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液，留下沉淀的微球。然后往微球沉淀中加入95 μL PBS和5 μL CD9抗體，充分混合均勻，放置在恒溫混勻儀上(25 ℃，300 r/min，4 h)，同樣的每隔20 min將試管取出并振蕩，以防微球沉淀；

5)微球儲存：將標記好抗體的微球以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液，留下沉淀的微球，加入100 μL PBS溶液重懸，放入4 ℃儲存。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 芯片的結(jié)構(gòu)

如圖2(a)所示，一塊玻璃片上鍵合有2塊PDMS芯片， PDMS芯片尺寸為1.8 cm×1.8 cm，每塊芯片內(nèi)部含有4個結(jié)構(gòu)單元，每個結(jié)構(gòu)單元由進樣口、出樣口和主體部分的微柱陣列組成，溝道深度為20 μm。微柱陣列包含有10排總計604個微柱，每個微柱長90 μm，寬30 μm，每排微柱的間距為90 μm，每排內(nèi)相鄰微柱間距為14 μm，如圖2(b)所示。芯片的進樣口和出樣口分別設置在芯片的對角線兩端，進樣口處設置有過濾柱的結(jié)構(gòu)，過濾柱的直徑為70 μm，如圖2(c)所示為硅片模具的SEM電鏡照片。圖2(d)為單個過濾柱柱面的結(jié)構(gòu)形貌，可見深反應離子刻蝕的柱面圖形結(jié)構(gòu)完整，側(cè)壁陡直。

圖2 芯片結(jié)構(gòu)

2.2 芯片的流體動力學仿真與分析

納維—斯托克斯(Navier-Stokes，N-S)方程是流體力學的基本方程之一[18,19]，是描述粘性流體動量守恒的運動方程，形式為

圖3 芯片的仿真結(jié)果

微球在相鄰兩行微柱壓力差的作用下轉(zhuǎn)向，流向流阻較小的副通道，最終陷于副通道之中。一旦某個副通道被一個微球占據(jù)，該副通道的流阻會驟增，而后續(xù)通過的微球就會略過已被占據(jù)的副通道而繼續(xù)流向其它空的副通道。因此在微陣列中就不會發(fā)生微球堆積在同一副通道的情況，最終實現(xiàn)了整塊芯片內(nèi)微球的均勻排布。如圖4所示為副通道被微球占據(jù)后流速和壓力分布的變化，圖中的實線表示芯片內(nèi)流體的流線，可見當副通道被占據(jù)后，芯片內(nèi)流向發(fā)生明顯變化。

圖4 微球填充后芯片仿真結(jié)果的變化

2.3 外泌體定量檢測的結(jié)果

外泌體的分離檢測是外泌體相關研究工作的基礎，傳統(tǒng)的外泌體分離與定量檢測往往依賴昂貴的儀器，且費時費力，如何快速、經(jīng)濟地分離檢測外泌體是當前外泌體研究領域亟待解決的問題。本實驗利用前文描述的微陣列芯片，選取A549細胞培養(yǎng)上清液超速離心提取的標準外泌體樣本作為待測樣品，利用CD9標記的微球捕獲外泌體、量子點探針對微球捕獲到的外泌體進行檢測，分別對外泌體原液、稀釋10倍、100倍、1000倍的樣品進行了測定，如圖5所示為顯微鏡下觀察到的微球在芯片內(nèi)均勻排布的明場圖像和熒光圖像。

圖5 微球在芯片內(nèi)排布的圖片

使用Image Pro Plus 6.0軟件對每個微球的熒光強度進行統(tǒng)計，計算出芯片內(nèi)微球熒光強度的平均值，對統(tǒng)計結(jié)果進行半對數(shù)擬合，如圖6所示為對熒光強度統(tǒng)計分析得到的結(jié)果。最終得到擬合函數(shù)

y=15.7×lgx-45.07

(2)

擬合優(yōu)度是指回歸直線對觀測值的擬合程度，度量擬合優(yōu)度的統(tǒng)計量是確定系數(shù)R2。R2的值越接近1，說明回歸直線對觀測值的擬合程度越好；反之，R2的值越小，說明回歸直線對觀測值的擬合程度越差。本研究中，擬合函數(shù)的R2為0.996 5，說明對檢測結(jié)果有著很好的擬合效果。

圖6 對檢測結(jié)果的半對數(shù)擬合

3 結(jié) 論

通過COMSOL MultiPhysics 5.2仿真軟件對本文提出的基于微球均勻排布的外泌體檢測芯片進行了仿真，結(jié)合N-S方程分析了該芯片的工作原理。并對外泌體樣本進行了熒光定量測定，通過半對數(shù)擬合對檢測結(jié)果進行分析，結(jié)果呈現(xiàn)很好的對數(shù)線性關系(R2=0.996 5)，可以實現(xiàn)對外泌體的定量測定，檢測下限可以達到104個/mL。這種微球均勻排布的外泌體檢測芯片解決了以往同類研究中存在的微球堆積問題，避免了微球間熒光信號的干擾，可以達到更高的檢測精度與靈敏度。同時結(jié)構(gòu)簡單，反應快速，可重現(xiàn)性好，避免了對外加場的依賴，具有一定的的臨床應用前景。