趙 華，茅建輝

0 引言

竭紅跌打酊處方源于衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十四冊，是由紅花、兒茶、蘇木、當(dāng)歸尾、白礬等10味中藥材提取加工而成的中成藥復(fù)方制劑，具有散瘀消腫、活絡(luò)止痛的功效，主要用于跌傷、筋骨扭傷、積瘀腫痛等病癥的治療[1]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對竭紅跌打酊方中任何成分進行定量測定，也未檢索到對該制劑進行含量測定的文獻(xiàn)報道。隨著國家對中醫(yī)藥監(jiān)管的力度不斷加大，多成分定量測定已逐漸成為中成藥復(fù)方制劑常用的質(zhì)量評價模式，一測多評法利用中成藥復(fù)方制劑中所含成分內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系，通過測定其中一個代表性成分(易得、穩(wěn)定、廉價、有效)，建立其他成分與該成分間的相對校正因子，達(dá)到同時測定中成藥復(fù)方制劑中多成分含量的目的，有效地解決了多成分同時測定檢驗成本高、操作繁瑣等不足，一測多評法已成為中成藥復(fù)方制劑質(zhì)量評價的發(fā)展趨勢。為全面有效地控制竭紅跌打酊的產(chǎn)品質(zhì)量，本文以竭紅跌打酊中主要藥味紅花、兒茶和蘇木為研究對象，選取兒茶素為內(nèi)標(biāo)物，建立兒茶素與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B之間的相對校正因子，并計算其含量，探討一測多評法對竭紅跌打酊中5種成分同時定量測定的可行性及準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；竭紅跌打酊(規(guī)格：300 ml/瓶；批號：170085、170092、180013)來源于國藥集團馮了性(佛山)藥業(yè)有限公司；羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201810，含量：93.1%)、兒茶素對照品(批號：110877-201604，含量：99.2%)、表兒茶素對照品(批號：110878-201703，含量：99.7%)、(±)原蘇木素B對照品(批號：111882-201302，含量：89.9%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；巴西蘇木素對照品(批號：474-07-7，含量：98.0%)來源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～13.0 min，10.0%A；13.0～19.0 min，10.0%A→15.0%A；19.0～31.0 min，15.0%A→22.0%A；31.0～43.0 min，22.0%A→36.0%A；43.0～50.0 min，36.0%A→10.0%A)；0～19.0 min時在403 nm[2-5]波長下檢測羥基紅花黃色素A，19.0～50.0 min在280 nm[2,6-9]波長下檢測兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B；流速：0.9 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B對照品各適量，用80%甲醇分別制成每1 ml含0.698、1.012、0.576、0.382、0.218 mg的對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 依次精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液各2.5 ml，用80%甲醇[10]制成羥基紅花黃色素A 0.034 9 mg/ml、兒茶素0.050 6 mg/ml、表兒茶素0.028 8 mg/ml、巴西蘇木素0.019 1 mg/ml、(±)原蘇木素B 0.010 9 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.3 線性考察混標(biāo)溶液 依次精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液各2.0 ml，置于同一10 ml量瓶中，搖勻，作為線性考察混標(biāo)溶液Ⅰ，再精密吸取線性考察混標(biāo)溶液Ⅰ各適量，依次用80%甲醇稀釋2、4、8、16、20倍，分別制成線性考察混標(biāo)溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。

2.2.4 竭紅跌打酊供試品溶液 精密量取竭紅跌打酊1.0 ml，置25 ml量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成竭紅跌打酊供試品溶液。

2.2.5 陰性樣品溶液 按竭紅跌打酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下的處方和制備工藝，分別制備不含紅花的陰性樣品、不含兒茶的陰性樣品和不含蘇木的的陰性樣品，分別按照“2.2.4”項下所述的竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制成相應(yīng)的3種陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液、竭紅跌打酊供試品溶液、紅花陰性樣品溶液、兒茶陰性樣品溶液和蘇木陰性樣品溶液各適量，依法進樣測定，結(jié)果見圖1。所測色譜峰羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與其相鄰色譜峰能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以所測各成分色譜峰計均大于4 500，陰性樣品對測定無干擾。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 精密吸取“2.2.3”項下制備的線性考察混標(biāo)溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各適量，分別依法進樣檢測，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B峰面積，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表1。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.2”項下的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B峰面積，結(jié)果所測5個成分峰面積的RSD分別為1.01%、0.66%、1.09%、1.14%、1.23%。

圖1 色譜圖

注：A.混合對照品，B.竭紅跌打酊，C.紅花陰性樣品，D.兒茶陰性樣品，E.蘇木陰性樣品；1.羥基紅花黃色素A，2.兒茶素，3.表兒茶

素，4.巴西蘇木素，5.(±)原蘇木素B

2.3.4 重現(xiàn)性試驗 取同一批次竭紅跌打酊，按照“2.2.4”項下竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定，分別計算羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的含量，結(jié)果顯示，所測組分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的RSD依次為1.42%、1.35%、0.51%、1.72%和0.84%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次竭紅跌打酊樣品的同一份供試品溶液，分別于室溫下0、2、4、6、12、16、24 h進樣檢測，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積，結(jié)果表明，竭紅跌打酊供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積RSD分別為0.98%、0.59%、1.05%、1.08%、1.19%。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的竭紅跌打酊適量，分別精密量取0.5，分置不同的25 ml量瓶中，依次精密加入羥基紅花黃色素A對照品溶液(0.374 mg/ml)、兒茶素對照品溶液(0.569 mg/ml)、表兒茶素對照品溶液(0.307 mg/ml)、巴西蘇木素對照品溶液(0.215 mg/ml)和(±)原蘇木素B對照品溶液(0.133 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml，按照“2.2.4”項下竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制備加樣供試品溶液，依次進樣測定，結(jié)果所測成分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的平均加樣回收率見表2。

2.4 相對校正因子(fk/s)的計算 精密吸取“2.2.3”項下制備的線性考察混標(biāo)溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各適量，依法進樣測定羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積，以兒茶素為內(nèi)標(biāo)物，按照相對校正因子計算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W為所測成分質(zhì)量濃度，A為所測成分峰面積，k為內(nèi)標(biāo)物，s為其他待測成分)分別計算內(nèi)標(biāo)物與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表2 羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的回收率

表3 以兒茶素為內(nèi)標(biāo)的相對校正因子

2.5 相對校正因子的重復(fù)性考察 取“2.2.2”項下制備的混合對照品溶液分別進樣測定，考察Agilent 1260型高效液相色譜儀、Waters 2695型液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18色譜柱、Kromasil C18色譜柱、Hypersil ODS C18色譜柱對相對校正因子的影響，按照相對校正因子計算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W為所測成分質(zhì)量濃度，A為所測成分峰面積，k為內(nèi)標(biāo)物，s為其他待測成分)計算相對校正因子，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明，不同儀器與不同色譜柱對所測成分羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子無顯著影響。

表4 各因素對相對校正因子的影響

2.6 待測成分色譜峰定位 保證所建立的相對校正因子得以準(zhǔn)確應(yīng)用的前提條件是色譜峰的準(zhǔn)確定位。以表兒茶素為內(nèi)標(biāo)物，采用相對保留值法考察在不同儀器、不同色譜柱條件下羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與內(nèi)標(biāo)物兒茶素的相對保留值。實驗結(jié)果表明,不同儀器、不同色譜柱條件下，羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與內(nèi)標(biāo)物兒茶素的相對保留值無明顯差異，結(jié)果見表5。

3 樣品測定

取3批竭紅跌打酊，批號為170085、170092、180013，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的含量，結(jié)果見表6。實驗結(jié)果表明,外標(biāo)法所測結(jié)果和一測多評法計算結(jié)果無顯著差異，相對校正因子可信度較高，所建立的一測多評法可用于竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的同時測定。

4 討論

4.1 流動相的選擇 流動相對色譜峰具有明顯的影響，通過比較所測各成分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B色譜峰的峰形、分離度及保留時間，筆者對比考察了甲醇-水流動相體系、乙腈-水流動相體系[10]、乙腈-0.2%磷酸溶液流動相體系[4-5]、乙腈-0.2%冰醋酸溶液流動相體系[9]和乙腈-0.2%甲酸溶液流動相體系[3,11]，優(yōu)選最佳的流動相體系為乙腈-0.2%磷酸溶液流動相體系。在此實驗基礎(chǔ)上，通過對乙腈與0.2%磷酸溶液流動相比例的不斷摸索和對比試驗，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，按照文中“2.1”項下的梯度洗脫比例實現(xiàn)對竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的同時測定。

4.2 待測成分的選擇及內(nèi)標(biāo)物的確定 竭紅跌打酊是由紅花、兒茶、蘇木、當(dāng)歸尾、白礬等10味中藥材加工而成的中成藥復(fù)方制劑，所含成分復(fù)雜，具有多成分多靶點的作用特點，紅花、蘇木、當(dāng)歸尾活血散瘀、消腫止痛，為方中君藥；附以乳香、沒藥、血竭祛瘀止痛、消腫生肌，兒茶、白礬收斂止血，蘆薈清熱散瘀，安息香行氣活血，諸藥合用，共成散瘀消腫、活絡(luò)止痛之效。根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的原則，本文選取竭紅跌打酊中主要藥味紅花的代表性成分羥基紅花黃色素A、蘇木的代表性成分巴西蘇木素和(±)原蘇木素B、兒茶的代表性成分兒茶素和表兒茶素為檢測指標(biāo)，同時選取對照品穩(wěn)定、價格較低的兒茶素為內(nèi)標(biāo)物，通過建立內(nèi)標(biāo)物兒茶素與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子，實現(xiàn)一測多評法對竭紅跌打酊中多指標(biāo)成分的同時測定。

表5 各因素對相對保留值的影響

表6 含量測定結(jié)果(n=3，mg/ml)

5 小結(jié)

本實驗建立的一測多評法同時測定竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量具有操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，有效地解決了多成分同時測定質(zhì)量評價模式檢驗成本高的問題，為提高和修訂竭紅跌打酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實驗數(shù)據(jù)。