李秀麗，鄭緒峰，姜遠(yuǎn)茂，魏紹沖

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東泰安 271018）

氮是果樹正常生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，在保證植物正常代謝和生物量增加方面具有重要的作用。適量的氮肥供應(yīng)可以促進(jìn)果樹的營養(yǎng)生長、花芽分化，增強(qiáng)葉片的光合作用，進(jìn)而提高果實的產(chǎn)量與品質(zhì)[1]。但目前我國果園氮肥施用量遠(yuǎn)超出果品最佳產(chǎn)量的需要量，高產(chǎn)果園每年氮肥施用量高達(dá)400～600 kg/hm2，約為國外施氮量的4～5倍[2]。過多的氮肥用量不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，而且易引起環(huán)境污染和果實品質(zhì)下降等一系列不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的負(fù)面影響[3]。果園土壤保肥能力差，導(dǎo)致氮肥用量大，而氮肥過量施用則加劇了果園土壤的氮素環(huán)境負(fù)荷，降低果園土壤質(zhì)量，反過來促使果園氮肥用量增加，形成惡性循環(huán)[4]。因此，從保護(hù)環(huán)境和改善果實品質(zhì)等多方面考慮，減少氮肥用量并相應(yīng)地提高氮肥利用效率是目前果樹生產(chǎn)上亟待解決的問題，是綠色果業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保障。

植物激素乙烯是一種簡單的氣態(tài)植物激素，它不僅能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境脅迫，而且還影響營養(yǎng)元素吸收利用過程中的信號轉(zhuǎn)換，與植株對養(yǎng)分的吸收利用效率密切相關(guān)[5]。但是目前有關(guān)乙烯與植物營養(yǎng)元素利用之間的關(guān)系報道較少，它們之間的相互作用可以被應(yīng)用于調(diào)節(jié)植物響應(yīng)不斷變化的環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面[6]。許晅發(fā)現(xiàn)乙烯生成前體物ACC (氨基環(huán)丙烷羧酸) 處理可以誘導(dǎo)玉米根系產(chǎn)生更多根毛，增大根系吸收面積和提高根系活力，從而增強(qiáng)植株對養(yǎng)分的吸收和利用能力[7]。在0～120 mg/kg等間隔的4種土壤氮水平下，200 μL/L乙烯利處理均可以改變芥菜葉片氣孔導(dǎo)度、葉片光合速率、植株生物量以及氮素的利用效率[8]。在氮素供應(yīng)充足的條件下，乙烯利處理對氮肥利用率的影響效果尤為顯著[9]。

本試驗以現(xiàn)代蘋果生產(chǎn)中常用矮化砧木T337幼苗為試驗材料，分析比較葉面噴施乙烯利對硝酸還原酶 (nitrate reductase，NR) 和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 活性，以及氮素吸收、分配和利用的影響，以期為果樹生產(chǎn)管理中氮肥高效利用提供合理的科學(xué)依據(jù)及新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2017年3—9月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站進(jìn)行，以蘋果矮化自根砧T337幼苗為試驗材料。待幼苗在育苗基質(zhì)中長至9片葉左右時，選取生長勢和大小基本一致的幼苗定植于塑料盆中，每板15孔，每孔定植3株，每盆45株。每盆加入營養(yǎng)液3 L。先用1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)7天后，再換為完全營養(yǎng)液培養(yǎng)25 天，隨后饑餓處理7天，以消耗幼苗中貯存氮，預(yù)處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入改良Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。以Ca(15NO3)2(上?；ぱ芯吭荷a(chǎn)，豐度為10.16%) 為營養(yǎng)液唯一氮源，氮濃度為10 mmol/L。分別對幼苗葉片噴施清水或乙烯利。試驗中所有溶液均用蒸餾水配制，各營養(yǎng)元素所用試劑純度為分析純，每日定時通氣。

乙烯利處理濃度為：E1，200 μL/L；E2，400 μL/L；對照為噴清水 (CK)。每個處理重復(fù)4次，每盆為1個重復(fù)。處理后每隔4天取樣，分別測定不同處理幼苗根系活力及根系和葉片的硝酸還原酶 (NR)和谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性，并于處理后第20天取樣分析幼苗15N的吸收、分配和利用。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 根系活力 每個處理選取9株幼苗，采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 法測定，用四氮唑的還原強(qiáng)度[μg/(g·h)]表示根系活力。

1.2.2 硝酸還原酶活性 根系和葉片中的硝酸還原酶活性參照李合生的活體法測定[10]。測定各處理生成的紅色偶氮化合物在540 nm波長下的最大吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算樣品中NR活性[μg/(g·h)]。

1.2.3 谷氨酰胺合成酶活性 根系和葉片中谷氨酰胺合成酶活性的測定參照趙世杰等的方法[11]。分別提取根系和葉片粗酶液，與反應(yīng)液和ATP混勻后，加入顯色劑，離心，取上清液測定540 nm處的吸光值來表示 GS 活性[A/(mg·h)]。

1.2.4 幼苗15N吸收、分配和利用 處理20 d后將15N標(biāo)記幼苗清洗干凈，解析為根、莖、葉三部分，在105℃下殺青30 min，隨后在80℃下烘干至恒重。樣品用不銹鋼電磨粉碎后過60目篩，混勻后裝袋備用，測定各器官15N豐度和器官全氮量。樣品全氮用凱氏定氮法測定，15N豐度在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所用MAT-251氣體同位素質(zhì)譜儀 (美國菲尼公司) 測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

主要計算公式：

Ndff (%) = (植物樣品中15N豐度% -15N自然豐度%) / (肥料中15N豐度% -15N自然豐度%) × 100

器官15N吸收量 (g) = Ndff × 器官全氮量 (g)

器官全氮量 (g) = 器官生物量 (g) × 氮含量 (%)

氮肥利用率 (%) =15N吸收量 (g)/施肥量 (g) × 100

氮肥分配率 (%) = 各器官從氮肥中吸收的氮量(g) / 總吸收氮量 (g) × 100

試驗數(shù)據(jù)采用SPASS19.0進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行圖表繪制，圖表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利對幼苗根系活力的影響

乙烯利處理后幼苗的根系活力均不同程度高于同時期的對照(圖1)。各處理根系活力隨處理時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第8天達(dá)到最大值，且不同處理間差異顯著，E1、E2處理分別比對照高19.68%和63.40%。在處理后20天內(nèi)，E2處理幼苗根系活力一直明顯高于同期的對照。

圖1 噴乙烯利后T337幼苗根系活力Fig. 1 Root activities of T337 seedlings after ethephon spray

2.2 乙烯利對幼苗硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

2.2.1 乙烯利對葉片硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

處理后8～12天內(nèi)，乙烯利處理的幼苗葉片中NR活性明顯高于對照，在第8 天不同處理的葉片NR活性均達(dá)到最大值，兩個不同濃度乙烯利處理的NR活性分別比對照高17.30%和39.38%；而16～20天的兩個處理葉片中NR活性則顯著低于對照，而且E2處理葉片NR活性低于E1(圖2A)。

2.2.2 乙烯利對根系硝酸還原酶 (NR) 活性的影響

比較幼苗葉片和根系部位處理后同一時期的NR活性，可發(fā)現(xiàn)對照和E1處理幼苗葉片中的NR活性在20天內(nèi)一直高于同期的根系的，而E2處理12天內(nèi)葉片的NR活性高于根系的，但16天后根系中的NR活性反而高于葉片的。由此推測，葉片可能在幼苗硝態(tài)氮的同化利用中更關(guān)鍵 (圖2)。

圖2 噴乙烯利后幼苗葉片和根系硝酸還原酶活性Fig. 2 Nitrate reductase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

與處理后葉片NR活性變化相似，第8天時各個處理根系NR活性也均達(dá)到最高，其中E1和E2處理的根系NR活性分別比對照提高21.54%和36.01%。第12天后根系中的NR活性呈現(xiàn)下降趨勢，但是同期根的 NR 活性為 E2 〉 E1 〉 CK 處理 (圖 2B)。

2.3 乙烯利對幼苗谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性的影響

2.3.1 乙烯利對葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響處理后12天內(nèi)兩個處理葉片中GS活性比同一時期對照的高，在第8 d各處理之間GS活性差異顯著(圖3A)。E2處理葉片GS活性在4、8、12天時分別比對照高55.70%、81.03%和46.53%；E1處理葉片GS活性在第8天增幅最大，比對照增加36.21%。12天后葉片中GS活性下降，16天和20天時各處理之間差異不顯著。至第20天時，各種處理GS活性均降到0.80 A/(mg·h)左右。

2.3.2 乙烯利對幼苗根系谷氨酰胺合成酶活性的影響

對照幼苗僅在第4天時根系的GS活性低于葉片，8天后葉片GS活性一直高于根系，推測這可能是幼苗從饑餓狀態(tài)轉(zhuǎn)移到全硝態(tài)氮營養(yǎng)液后，根系吸收的氮素前期在根部被直接轉(zhuǎn)化利用有關(guān)。

根部GS活性隨處理時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖3B)。但乙烯利處理的幼苗根系中GS活性比對照高，其中E2處理根中GS活性在8天和12天期間分別比對照顯著提高了90.18%和85.90%。12～20天期間各處理根中GS活性出現(xiàn)下降趨勢，但同一時期不同處理間GS活性差異不顯著。

圖3 噴乙烯利后葉片和根系谷氨酰胺合成酶 (GS) 活性Fig. 3 Glutamine synthetase activity in T337 seedling leaves and roots after ethephon spray

2.4 乙烯利對幼苗生物量的影響

表1表明，乙烯利處理的幼苗總干重比對照顯著增加，E1和E2處理分別比對照增加20.88%和39.07%。E1處理葉片干重比對照顯著增加，但根和莖干重與對照差異不顯著。E2處理根系和葉片干重顯著高于對照，分別比對照增加86.96%和28.83%。與對照相比，乙烯利處理的幼苗根冠比增加，其中E2處理差異顯著，比對照增加42.86%。

表1 噴乙烯利后幼苗各器官的生物量 (g)Table 1 Biomass of seedling organs after ethephon spray

2.5 乙烯利對幼苗各器官15N吸收利用和分配的影響

2.5.1 乙烯利對幼苗各器官Ndff值的影響

Ndff是指植株器官從肥料15N中吸收分配到的15N量對該器官全氮量的貢獻(xiàn)率，它反映了器官對肥料15N的吸收征調(diào)能力[12]。

與對照相比，E1處理幼苗各部位的Ndff值差異不顯著；E2處理根的Ndff值比對照顯著增加了63.14%，而莖和葉片的Ndff值差異不顯著。說明E2處理可以顯著提高幼苗根系對15N的吸收征調(diào)能力 (表2)。

表2 噴乙烯利后幼苗各器官的Ndff值 (%)Table 2 Ndff (%) in various organs of seedlings after ethephon spray

2.5.2 乙烯利對幼苗15N利用率和15N分配率的影響

器官中15N占全株15N總量的百分率反映了氮在植株中的分布及在各器官遷移的規(guī)律[13]。表3中，不同處理幼苗器官中15N的分配率均為葉 〉 根 〉 莖。E1和E2處理葉片中15N的分配率分別比對照降低了20.4%和30.6%，相應(yīng)地，乙烯利處理顯著提高了幼苗根和莖15N的分配率，E1、E2兩個處理根系15N的分配率分別比對照提高33.3%、67.4%，可見E2處理對根系15N分配率提高幅度尤為明顯。

表3 噴乙烯利后T337幼苗15N的分配率 (%)Table 3 15N distribution rate of T337 seedlings after ethephon spray

從圖4可以看出，不同處理的幼苗15N利用率差異顯著，由高至低依次為E2 〉 E1 〉 CK。E1和E2處理的幼苗15N利用率分別達(dá)到12.91%和24.79%，而對照僅為9.47%，可見乙烯利處理顯著提高T337幼苗15N的利用率，E1和E2處理15N的利用率分別比對照高3.44和15.32個百分點。

圖4 噴乙烯利后T337幼苗的15N利用率Fig. 4 15N use efficiency of T337 seedlings after ethephon spray

3 討論

3.1 乙烯利對T337幼苗氮代謝相關(guān)酶活性的影響

果樹從土壤中吸收的無機(jī)態(tài)氮主要為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，其中根系吸收的硝酸鹽在植物體內(nèi)需進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酸和谷氨酰胺等有機(jī)氮才能被植物同化利用，而NR和GS是其轉(zhuǎn)化過程中兩個關(guān)鍵酶[14]。氮素充足條件下乙烯利處理芥菜10天后，光合速率可比對照高40.3%，葉片中NR活性和氮含量分別比對照高35.9%和26.8%，最終引起植株生物量表現(xiàn)出明顯差異[15]。研究表明，外源乙烯能促進(jìn)側(cè)根的生長和伸長，增大根系吸收面積，顯著提高根系活力[16-17]。劉劍鋒等發(fā)現(xiàn)，玉米無論在干旱或復(fù)水條件下，乙烯利處理均能促進(jìn)其根系生長，并提高葉片中NR活性和GS活性[18]。本試驗結(jié)果表明，不同處理T337幼苗根系及葉片中NR活性和GS活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在第8天達(dá)到最大值。推測這可能與硝酸還原酶活性誘導(dǎo)有關(guān)，當(dāng)幼苗從饑餓狀態(tài)轉(zhuǎn)移到全硝態(tài)氮營養(yǎng)液后，根系會從營養(yǎng)液中大量吸收硝態(tài)氮，從而誘導(dǎo)葉片和根系部位NR及GS活性上升，而隨著營養(yǎng)液硝態(tài)氮不斷被幼苗轉(zhuǎn)化利用，兩種酶的活性隨后開始下降，這種變化與根系活力表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢是一致的。乙烯利處理提高根系活力，增強(qiáng)根系對硝態(tài)氮的吸收能力，另一方面也提高了葉片和根系的NR及GS活性，因此會影響幼苗中硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化利用，最終導(dǎo)致乙烯利處理的幼苗生物量高于對照。

3.2 乙烯利對T337幼苗氮素吸收、利用和分配的影響

硝態(tài)氮是果樹重要的無機(jī)氮營養(yǎng)形態(tài)，多數(shù)試驗證明果樹是喜硝作物[19]。進(jìn)入植物體內(nèi)的硝態(tài)氮，如果不能被及時同化和利用，將會明顯影響植株的氮素同化效率和生物量的形成，進(jìn)而顯著影響植物的氮利用效率[20-21]。

當(dāng)土壤環(huán)境中養(yǎng)分供應(yīng)發(fā)生變化時，植物根系也會發(fā)生一些適應(yīng)性改變[22]。研究表明，乙烯利對植物營養(yǎng)元素的吸收利用具有重要影響。例如，營養(yǎng)元素缺乏條件下植物產(chǎn)生的乙烯可以增大根系的總吸收表面，提高轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量等以更好地滿足植物的正常生長和養(yǎng)分需求[6]。

不同供氮水平下，芥菜噴施乙烯利后，葉片的光合速率及植株生物量均顯著高于對照，并且在氮供應(yīng)充足水平下尤為明顯，原因主要與處理后葉片氣孔導(dǎo)度增大和胞間CO2濃度升高有關(guān)[9]。不同品種對乙烯處理的響應(yīng)有較大差異，4個不同品種芥菜噴施乙烯利后，對乙烯反應(yīng)最敏感型品種‘Pusa Jai Kisan’葉片中Rubisco酶的活性及光合速率增加顯著高于其它品種[23]。

本試驗中乙烯利處理的幼苗總生物量，尤其是400 μL/L處理，根系部位的生物量顯著高于對照，推測這可能與T337幼苗對乙烯反應(yīng)的敏感性較高有關(guān)。乙烯利處理后的幼苗光合產(chǎn)物向地下部供應(yīng)增加，促進(jìn)幼苗根系生長并增強(qiáng)根系對硝態(tài)氮的吸收能力；而地上部分葉片由于受氮素供應(yīng)限制，生長會受到一定程度的影響，因此幼苗根冠比增大，最終導(dǎo)致不同處理的根系氮素分配率存在明顯差異，至試驗結(jié)束時，200 μL/L和400 μL/L乙烯利處理的幼苗根系15N分配率分別比對照增加33.32%和67.40%。

高氮供應(yīng)條件下T337幼苗氮素同化和根系生長會受到抑制[24]。本試驗結(jié)果表明乙烯利能夠提高根系的氮素分配率，促進(jìn)T337幼苗地下部的生長，提高根冠比。乙烯利處理的幼苗根系和葉片對硝態(tài)氮的同化能力明顯加強(qiáng)，最終顯著提高幼苗硝態(tài)氮利用率。200 μL/L和400 μL/L乙烯利處理的幼苗15N利用率比對照分別高3.44和15.32個百分點。本試驗結(jié)果為生產(chǎn)中提高果樹氮肥利用率及改善氮素分配提供了新思路，但相關(guān)研究還有待在田間試驗條件下進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

葉片噴施適量的乙烯利能夠提高T337幼苗的根系活力，增強(qiáng)根系及葉片中GS和NR的活性，促進(jìn)體內(nèi)硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化及利用，從而提高幼苗氮肥利用率及根系部位氮素的分配率，增大根冠比。