代曉航 魏 超

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心， 成都 610066; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(成都), 成都 610066)

0 引言

食用菌作為我國的第五大農(nóng)作物，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展已形成可持續(xù)性的趨勢及特色，至2015年，其生產(chǎn)規(guī)模占世界產(chǎn)量的73.57%[1-2]。食用菌產(chǎn)業(yè)有效促進了中國貧困地區(qū)的脫貧致富，在一定程度上解決了“三農(nóng)”問題[3]。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了大量的廢棄菌棒，隨意丟棄的廢棄菌棒，將污染土壤和水體，其對環(huán)境的影響不可低估。有機肥制作是將農(nóng)業(yè)產(chǎn)物變廢為寶的途徑。廢菌棒作為食用菌種植后的廢棄原料，在出菇后理化結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，N、P、K含量變得更加豐富，更有利于農(nóng)作物的生長，同時可增加土壤微生物多樣性[4-6]。以往對于農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥微生物多樣性研究多集中在秸稈、動物糞便、樹葉等方面，而對廢棄菌棒堆肥中微生物多樣性研究較少[7-9]。

高通量測序的方法目前已被廣泛應(yīng)用于水體、土壤、疾病等微生物群落的研究中，能更真實地揭示微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，對不可培養(yǎng)和痕量微生物的研究具有明顯優(yōu)勢，同時可揭示種群差異、功能特點等重要信息[10-12]。本實驗以平菇菌渣為主要原料，以添加兩種不同的輔料(牛糞、草炭)腐熟完成后的有機肥料為研究對象，采用高通量測序方法對樣品中細菌、真菌多樣性及差異進行研究，為提高以菌渣為主要原料生產(chǎn)的有機肥質(zhì)量，以及后期肥料的使用提供相關(guān)依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集自四川某菌渣有機肥生產(chǎn)基地。堆肥為草垛式高溫堆肥，高2.5 m，直徑約5 m。廢棄菌棒均先去菌袋等雜質(zhì)，粉碎均勻后，分別添加兩種類型的氮源(牛糞和草炭)，調(diào)節(jié)至相同含水率和碳氮比，進行高溫發(fā)酵，經(jīng)過30 d左右即腐熟完成。分別在堆肥的底部(距底10 cm處)、中部(距頂1.2 m處)、頂部(距頂10 cm處)，深度均為20～25 cm處隨機取樣，其中每個部位分別在堆肥的3個不同方向取樣后混合為1 個樣品,即每個樣品獲得3個平行樣,編號為NJ-1、NJ-2、NJ-3(菌棒+牛糞)、CJ-1、CJ-2、CJ-3(菌棒+草炭)，樣品名稱編號前面加B,代表為細菌檢測結(jié)果，樣品名稱編號前面加F,代表為真菌檢測結(jié)果。樣品去除雜質(zhì)后封裝于無菌袋中，-80℃保存，用于微生物分析。

1.2 樣品DNA提取、PCR 擴增及高通量測序

使用美國OMEGA公司E.Z.N.A試劑盒進行樣品DNA提取( Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美國)，用帶有barcode的特異引物擴增DNA樣本中16S rDNA的V3 + V4區(qū)和ITS2。16S引物序列為: 341F，CCTACGGGNGGCWGCAG;806R，GGACTACHVGGGTATCTAAT。ITS2引物序列為: ITS3_KY02F，GATGAAGAACGYAGYRAA;ITS4R，TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴增體系為：50 μL反應(yīng)體系中包含5 μL的10×KOD Buffer, 5 μL的2.5 mmol/L dNTPs, 1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL KOD聚合酶，100 ng模版 DNA。擴增條件為：95℃預(yù)變性2 min,隨后98℃變性10 s,62℃退火30 s, 68℃延伸30 s，共27個循環(huán)，最后68℃延伸10 min。對擴增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。 將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，根據(jù)Illumina官方說明構(gòu)建測序文庫，Hiseq2500的PE250模式上機測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1N比例過高的序列去除

去除reads中N堿基占比超過10%的序列，去除低質(zhì)量序列：去除質(zhì)量值高于20的堿基數(shù)占堿基總數(shù)的百分比小于40%的reads。

1.3.2Tags拼接

根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，使用FLASH(v 1.2.11)將成對雙端reads拼接為一條序列。拼接條件是最小匹配長度為10 bp，重疊區(qū)域允許的錯配率為2%。 拼接得到的序列稱為Raw Tags。

1.3.3Tags過濾

拼接得到的Raw Tags，需要經(jīng)過更嚴格的過濾處理后，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime(v1.9.1)的Tags質(zhì)量控制流程，進行如下操作：Tags截取，將Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認質(zhì)量閾值為小于等于3)堿基數(shù)達到設(shè)定長度(默認長度值為3)的第1個低質(zhì)量堿基位點截斷；Tags長度過濾，Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集，進一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。

1.3.4Tags去嵌合體

經(jīng)過以上處理后得到的Tags序列與數(shù)據(jù)庫(Gold database r20110519)進行比對(UCHIME Algorithm)檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了研究樣品的物種組成多樣性信息，用Uparse (Usearch v9.2.64)軟件對所有樣品的全部 Effective Tags 序列聚類。 默認將97%的一致性(Identity)序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units )結(jié)果， 并計算出每個OTU在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息，為后續(xù)的分析做準備。為了探明不同樣本或者分組之間的OTUs的共有或者特有信息，根據(jù)OTU序列在各個樣品中的分布情況，使用R語言的VennDiagram(v1.6.17)包和UpSetR(v1.3.3)包繪制韋恩圖，并統(tǒng)計各個集合所包含的OTUs。稀釋曲線(Rarefaction curve)用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富程度?；贠TU列表的物種豐度信息，使用R語言的gmodels (v2.16.2)包開展主成分分析(Principal component analysis，PCA)， PCA圖中的距離越近表明樣品組成越相似。

1.5 統(tǒng)計方法

不同配方有機肥能引起微生物α多樣性差異。結(jié)合分組和采樣信息，通過對兩組間的α多樣性進行假設(shè)檢驗，可以分析組間的物種多樣性是否存在顯著差異，從而初步判斷驅(qū)動群落多樣性變化的潛在因素等。本次研究使用T-test檢驗對2個組分(NJ和CJ，每組3個重復(fù)樣本)進行差異分析。P≤0.05表示差異顯著，P>0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組樣品微生物多樣性分析

通過對細菌16S rDNA的V3+V4區(qū)測序，菌棒+草炭(BCJ)和菌棒+牛糞(BNJ)樣品分別得到134 419、125 507條有效序列， 2 839、2 969個細菌OTU。通過對真菌ITS rDNA測序,FCJ和FNJ樣品分別得到了164 946、148 903條有效序列， 511、567個真菌OTU(表1)。兩組樣品的稀釋曲線見圖1。

表1 兩組樣品測序結(jié)果Tab.1 Results of rarefaction curve of high-throughput DNA sequencing library

圖1 群落高通量測序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of high-throughput DNA sequencing library of bacterial and eukaryotic microbial community

由圖1可見，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，分析得到的物種數(shù)量也逐漸増長,且稀釋曲線已趨于平穩(wěn)，說明測序基本已覆蓋所有物種。另外可以看出，牛糞+菌棒配方有機肥中微生物物種豐富度高于草炭+菌棒配方有機肥，且這種差異在真菌中表現(xiàn)得更明顯。

表1中通過比較2個處理的多樣性指數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，添加牛糞堆肥處理的細菌群落的豐富度高于添加草炭堆肥處理，但均勻度低于添加草炭的堆肥。添加牛糞堆肥處理的真菌群落的豐富度、均勻度均高于添加草炭堆肥處理。

通過對兩組樣品間的α多樣性進行假設(shè)檢驗， 分析組間的物種多樣性是否存在顯著的差異，結(jié)果見表2，牛糞+菌棒配方有機肥與草炭+菌棒配方有機肥群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(P均大于0.05)。

2.2 不同配方有機肥中微生物群落相似性分析

用于細菌分析的6份樣品平均獲得OTU 2 904條，涵蓋了6門、10綱、10目、10科、10屬，BNJ和BCJ之間的共有OTUs有2 042條，而兩組樣品特有的OTUs分別為927、797條，用于真菌分析的6份樣品平均獲得OTU 539條，涵蓋了2門、5綱、6目、7科、4屬。FNJ和FCJ之間的共有OTUs有350條，而兩組樣品特有的OTUs分別為217、161條(圖2)。

表2 兩組樣品群落結(jié)構(gòu)差異性分析結(jié)果Tab.2 Difference analysis results of community structure between two samples

圖2 兩種配方肥料中細菌和真菌群落OTU的維恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial and eukaryotic microbial OTUs among two treatments

2.3 兩種配方有機肥中群落差異分析

由圖3可知，細菌PCA1和PCA2分別解釋了樣本86.7%和9.5%的方差信息。兩者共計解釋96.2%的樣本信息。真菌PCA1和PCA2分別解釋了樣本65.9%和27.5%的方差信息。兩者共計解釋93.4%的樣本信息。表明在這兩個維度上能夠反映樣本的實際情況。同時，也可以看出，F(xiàn)NJ組內(nèi)，F(xiàn)NJ-1距組內(nèi)另外兩個樣品偏離較大，這可能跟樣品均勻性有關(guān)，兩組樣品間的群落差異分析主要參考FNJ-2和FNJ-3。

根據(jù)物種分類的表達譜數(shù)據(jù)，采用熱圖來展示不同的物種在各樣品間的表達情況，同時根據(jù)熱圖上的聚類關(guān)系，也可以反映樣本關(guān)系。為了減少噪聲數(shù)據(jù)的影響，挑選了至少一個樣本的相對豐度達到0.1%以上，同時相對總豐度在前25的物種進行熱圖分析，見圖4、5。熱圖中每列代表一個樣本；每行代表一個分類水平；顏色從紅到藍表示豐度從高到低。

圖3 群落主成分分析Fig.3 Principal components analysis of bacterial and fungi communities

圖4 群落物種相對豐度聚類圖Fig.4 Relative abundance of bacterial community species clustering figures at class and genus level

圖5 真菌在綱和屬水平上的分類Fig.5 Relative abundance of eukaryotic community species clustering figures at class and genus level

在綱水平上，BNJ相對于BCJ有3個優(yōu)勢菌綱，分別為Bacilli、Clostridia、S0134_terrestrial_group。BCJ相對BNJ有18個優(yōu)勢菌綱，分別為Alphaproteobacteria、Cytophagia、Solibacteres、Betaproteobacteria、Gemmatimonadetes、Sphingobacteriia、Mollicutes、Planctomycetacia、Verrucomicrobia、Thermomicrobia、Ktedonobacteria、Phycisphaerae、Caldilineae、Longimicrobia、Deltaprotoobacteria、Chloroflexia、Acidimicrobiia、Thermoleophilia。屬水平上，BNJ相對于BCJ有10個優(yōu)勢菌屬，分別為Bacillus、Ornithinibacillus、Oceanbacillus、Pseudomonas、Lutoimonas、Staphylococcus、Paeniclostridium、Saccharomonospora、Paucisalibacillus、Streptomyces。BCJ相對于BNJ有14個優(yōu)勢菌屬，分別為鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)、Brevundimonas、Flavobacterium、Parapedobacter、Collvibrio、Lysinibacillus、Simiduia、Iamia、德沃斯氏菌屬Devosia、海洋桿菌屬Pelagibacterium、Aminobacter、Mesorhizobium中生根瘤菌、Cellulosimicrobium、類芽孢桿菌Paenibacillus。

“菌棒+牛糞”配方的有機肥中芽孢桿菌(Bacillus)豐度更高。有機肥中的芽孢桿菌在土壤中可以起到增加有益微生物種類，加速和促進其他微生物對有機質(zhì)累積和磷素循環(huán)過程的作用，同時，許多芽孢桿菌能分泌大量的酶和抗生素，有效控制多種植物病害[13-14]。高豐度的鏈霉菌屬可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)如抗生素、殺蟲劑、除草劑、植物生長促進劑[15]。

“菌棒+草炭” 配方的有機肥中的優(yōu)勢菌屬，鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium) 能降解芳香族污染物，如多環(huán)芳香烴類物質(zhì)[16-17]。這些菌可降解土壤中有機污染物和肥料中有機物，從而減少污染物危害，促進植物的生長。類芽孢桿菌屬、耐熱芽孢桿菌和梭菌屬數(shù)量的增加，則有助于降解肥料中的有機物，改變土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，增加了微生物多樣性[18-20]。

綱水平上，F(xiàn)NJ相對于FCJ有3種優(yōu)勢真菌，分別為Eurotiomycetes、Saccharomycetes、Tremellomycetes。FCJ相對于FNJ也有3種優(yōu)勢真菌，分別為Dothideomycetes、Sordariomycetes、Leotiomycetes。屬水平上，F(xiàn)NJ相對于FCJ中優(yōu)勢真菌屬有6種，分別為Arachniotus、Pleurotus、Aspergillus、Microascus、Scopulariopsis、Arachnomyces。FCJ相對于FNJ有4種優(yōu)勢真菌屬，分別為Chaetomium、Gliocladium、Trichoderma、Lecanicillium。

圖6 FNJ中優(yōu)勢真菌在種水平上的分類Fig.6 Relative abundance of eukaryotic community species clustering figure at species level

“菌棒+牛糞”配方有機肥中優(yōu)勢菌Arachniotus是一種白腐菌，可用于提高纖維飼料的營養(yǎng)價值，特別是與固態(tài)發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，已被用于許多廢物的經(jīng)濟利用[21]。Aspergillus(曲霉屬)也是FNJ中的優(yōu)勢菌屬，但從種水平熱圖(圖6)來看，曲霉屬中Aspergillus_flavus(黃曲霉)和Aspergillus_subversicolor(雜色曲霉亞種)豐度較高，黃曲霉有30%～60%的菌株會產(chǎn)生毒素，雜曲霉毒素主要由雜色曲霉產(chǎn)生。有研究表明，一些農(nóng)作物易受到來自土壤毒素的污染，例如土壤就被認為是花生黃曲霉菌的主要來源，花生莢果中的黃曲霉菌與土壤中的黃曲霉菌有直接聯(lián)系[22-23]。

“菌棒+草炭” 配方有機肥中的優(yōu)勢菌Chaetomium(毛殼屬真菌)能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶，同時還可以降解纖維素和木質(zhì)素等大分子難降解有機物，具有拮抗土壤中某些微生物的作用[24]。Gliocladium(粉紅粘帚霉)、Trichoderma(木霉菌)、Lecanicillium(蠟蚧輪枝菌)都是重要的生防菌。

3 結(jié)束語

選取的“菌棒+草炭”和“菌棒+牛糞”兩種配方堆肥制得的有機肥微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著性差異，優(yōu)勢菌種類有一定的差異，但功能差異不大，均可在農(nóng)業(yè)灌溉中起到增加土壤微生物多樣性、促進植物生長的作用。研究發(fā)現(xiàn)了多種具有農(nóng)業(yè)價值的功能菌，可為功能性微生物的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。另外，也發(fā)現(xiàn)一些潛在危害因子，如黃曲霉和雜色曲霉亞種在“牛糞+菌棒”有機肥中豐度較高，產(chǎn)生的黃曲霉毒素、雜曲霉毒素易造成農(nóng)作物污染。因此，在生產(chǎn)和施用有機肥時，應(yīng)考慮產(chǎn)毒真菌帶入的風(fēng)險。