李觀強(qiáng) 張娟娟 梁 娟 林士軍 劉 智 李國保 曾常春 張國良

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳518172)

肺結(jié)核(Pulmonary tuberculosis,PTB)，屬于慢性傳染病，病因?yàn)楦腥窘Y(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，是傳染病中引起人類死亡的首要原因，在全球范圍內(nèi)，2017年新增了1 000多萬新發(fā)病例和160多萬死亡病例[1]，嚴(yán)重危害全球人類健康。因此，找出與肺結(jié)核相關(guān)基因，快速確診肺結(jié)核，對(duì)結(jié)核病的治療有重要意義。

單核細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，在宿主Mtb感染防御中屬于第一道防線[2]，單核細(xì)胞被激活后，可通過自噬、凋亡等多種機(jī)制將細(xì)胞內(nèi)的Mtb有效清除[3,4]。

miRNAs是存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度約20～25個(gè)核苷酸，能對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及免疫應(yīng)答等多環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響[5]。有學(xué)者的相關(guān)研究顯示在肺結(jié)核(PTB)、結(jié)核潛伏感染(Latent tuberculosis infection,LTBI)、健康捐獻(xiàn)者(Healthy donor,HD)中miRNAs表達(dá)譜存在差異[6-9]。miR-17～92簇是一個(gè)典型的miRNA家族成員。在人類基因組中，miR-17～92簇編碼6個(gè)miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-110。其中，針對(duì)miR-20a在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用的相關(guān)研究較多，有報(bào)道指出，在甲狀腺未分化癌中，其表達(dá)較高，并能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[10，11]。然而，在Mtb感染過程中，miR-20a是否發(fā)揮類似作用以及通過何種機(jī)制發(fā)揮作用仍然未知。因此，本研究重點(diǎn)探討在結(jié)核菌感染過程中單核細(xì)胞miR-20a的表達(dá)變化情況及其與肺結(jié)核診斷、治療的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 PTB人群來自深圳市第三人民醫(yī)院，LTBI、HD人群則為到龍崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸科就診者及自行體檢者。PTB診斷標(biāo)準(zhǔn)：以《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》(中華醫(yī)學(xué)會(huì)，2005年)中的相關(guān)診斷要求為參考，符合肺結(jié)核的臨床癥狀、體征，肺部陰影，痰涂片及結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測(cè)均為陽性，排除HBV、HCV、HIV、糖尿病等患者。LTBI人群：未見結(jié)核臨床表現(xiàn)， IFN-γ Elispot檢測(cè)陽性，無其他合并癥。HD人群的PPD實(shí)驗(yàn)和IFN-γ Elispot均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，最后入組PTB、LTBI、HD各5例。三組年齡、性別分布等基線資料接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理，經(jīng)兩院倫理委員會(huì)審核并獲得批準(zhǔn)，對(duì)象知情同意，本人簽署有關(guān)證明文書。

1.2方法

1.2.1分選外周血CD14+單核細(xì)胞 采集5 ml研究對(duì)象外周血，使用肝素鋰抗凝，分離PBMC(應(yīng)用密度梯度離心法)，取PBMC(1×107個(gè))以及5 μl CD14+免疫磁珠，均為德國Miltenyi公司生產(chǎn)，放入冰箱，4℃環(huán)境下孵育20 min后，應(yīng)用MACS自動(dòng)磁珠分選儀，將CD14+單核細(xì)胞分選出來。

1.2.2提取和測(cè)定總RNA 使用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒，具體操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，從每份樣本中選取1×106個(gè)CD14+單核細(xì)胞以提取總RNA。使用美國Agilent公司生產(chǎn)的超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和質(zhì)量，置入冰箱，在-80℃環(huán)境中長(zhǎng)期保存。

1.2.3miRNA表達(dá)譜的基因芯片檢測(cè) miRNA芯片檢測(cè)由深圳華大基因公司完成。按照丹麥Exiqon公司的miRCURY TM Hy3TM Power標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。先行miRNA的熒光標(biāo)記，再與miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)雜交。隨后使用美國Axon公司的Axon GenePix 4000B芯片掃描儀對(duì)芯片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描，使用聚類分析儀(Cluster 3.0)和樹狀視圖分析法來分析數(shù)據(jù)。

1.2.4TaqMan qPCR驗(yàn)證miRNA的差異表達(dá) 根據(jù)miRNA芯片結(jié)果，在大樣本人群中分別選取HD、LTBI、PTB各10例對(duì)具有明顯差異表達(dá)的miRNA分子進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用TaqManTMmiRNA cDNA 試劑盒完成，然后行qPCR擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系： 10.0 μl TaqManTMmaster mix,1.0 μl miRNA引物，1.5 μl cDNA，7.5 μl RNase free H2O。反應(yīng)條件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。以RNU6B作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5TaqMan qPCR檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核患者抗結(jié)核藥物治療前后miRNA的差異表達(dá) 選取5例活動(dòng)性肺結(jié)核患者，在抗結(jié)核藥物治療前及治療3個(gè)月、6個(gè)月后分別采集患者外周血，采用密度梯度離心法分離PBMC，使用免疫磁珠從PBMC中分選出CD14+單核細(xì)胞，最后采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒提取CD14+單核細(xì)胞的總RNA進(jìn)行TaqMan qPCR測(cè)定，分析miRNA的表達(dá)情況。

1.2.6體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 用H37Rv、H37Ra及BCG以MOI=10時(shí)分別感染分化的人單核細(xì)胞，37℃孵育，分別收集0、15、30、60、90、120、240、480 min時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，miR-20a-5p的表達(dá)量通過qPCR進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1三組CD14+單核細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜對(duì)比 三組對(duì)象中各選5例，收集外周血分離PBMC，隨后從PBMC中采用磁珠分選出CD14+單核細(xì)胞，再提取總RNA，進(jìn)行miRNA的熒光標(biāo)記后，將其與miRCURYTM LNA芯片的雜交,最后使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀對(duì)芯片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描，使用Significance Analysis of Microarrys 軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三組人群miRNA表達(dá)譜中，miR-20a-5p的表達(dá)差異最顯著，見圖1。

2.2TaqMan qPCR驗(yàn)證miR-20a-5p的差異表達(dá) 為驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果的可靠性，在大樣本的HD、LTBI、PTB三組人群中各選10例，總RNA樣本采用TaqMan qPCR方法檢測(cè)miR-20a-5p的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-20a-5p在三組人群中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中的表達(dá)水平顯著低于在HD和LTBI人群中的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.05)，如圖2所示，該結(jié)果與基因芯片的結(jié)果一致。

2.3活動(dòng)性肺結(jié)核患者抗結(jié)核藥治療后miR-20a-5p分子的表達(dá)情況 為了明確miR-20a-5p分子在抗結(jié)核藥物治療前后的變化情況，選取5位活動(dòng)性肺結(jié)核患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪，患者嚴(yán)格遵從醫(yī)囑，按時(shí)服藥，定期檢查。我們分別采集5位患者在用藥前，抗結(jié)核藥物治療3個(gè)月、6個(gè)月后的外周血再次檢測(cè)miR-20a-5p的表達(dá)。結(jié)果顯示，在用藥前，患者體內(nèi)miR-20a-5p的表達(dá)水平相對(duì)較低，隨著用藥時(shí)間的增加，miR-20a-5p的表達(dá)水平增加，如圖3所示，提示在活動(dòng)性肺結(jié)核患者藥物治療后，結(jié)核菌被清除或受抑制，而miR-20a-5p表達(dá)反而增加。

2.4體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在結(jié)核菌感染人單核細(xì)胞后miR-20a-5p分子的表達(dá) 為了在體外再次驗(yàn)證miR-20a-5p的表達(dá)情況，隨后我們用結(jié)核菌強(qiáng)毒株H37Rv、弱毒株H37Ra以及BCG在MOI=10時(shí)分別感染分化的人單核細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)(0～480 min)提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，三種菌株感染人單核細(xì)胞后，miR-20a-5p分子的表達(dá)均顯著下調(diào)，以弱菌株下調(diào)更為顯著，如圖4所示。

圖2 TaqMan qPCR驗(yàn)證miR-20a-5p在三組人群中的表達(dá)情況Fig.2 miR-20a-5p expression was confirmed by TaqMan qPCR among 3 groups

圖3 藥物治療前后miR-20a-5p分子的表達(dá)情況Fig.3 Expression of miR-20a-5p before and after drug treatment

圖4 BCG、H37Ra、H37Rv感染人單核細(xì)胞后miR-20a-5p分子的表達(dá)情況Fig.4 Expression of miR-20A-5P after BCG,H37Ra and H37Rv infecting human monocytes

3 討論

現(xiàn)階段，臨床抗結(jié)核藥物較多，吡嗪酰胺、異煙肼、乙胺丁醇、利福平等，均比較常用，但這些藥物使用后不僅容易產(chǎn)生副作用，嚴(yán)重影響其預(yù)后的生活質(zhì)量，而且容易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重阻礙抗結(jié)核的治療。因此，找出副作用少、療效佳的抗結(jié)核藥是治療結(jié)核病的重要方向。研究證實(shí)，miRNA可直接或間接實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控，參與細(xì)胞周期變化及其增殖與凋亡過程，在微生物感染過程中與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)核患者體內(nèi)表達(dá)各異的miRNA，可視為診斷結(jié)核的潛在生物標(biāo)識(shí)[13-15]。

本研究著眼于CD14+單核細(xì)胞，將其視為作用靶點(diǎn)，借助miRNA芯片技術(shù)，進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)和分析，結(jié)果證實(shí)，HD 、LTBI、 PTB人群中，miR-20a-5p是表達(dá)差異最顯著的miRNA，隨即采用TaqMan qPCR技術(shù)在大樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p分子在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中表達(dá)下調(diào)且表達(dá)水平顯著低于在HD和LTBI人群中的表達(dá)水平。當(dāng)活動(dòng)性肺結(jié)核患者在抗結(jié)核藥物治療后，miR-20a-5p的表達(dá)水平逐漸上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)核菌感染后人體單核細(xì)胞內(nèi)miR-20a-5p表達(dá)下調(diào)，在抗結(jié)核治療后miR-20a-5p的下調(diào)可逆轉(zhuǎn)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)用BCG、H37Ra、H37Rv在MOI=10時(shí)分別感染分化的人單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)三種菌株均明顯抑制miR-20a-5p表達(dá)，而以弱毒株下調(diào)最為顯著。由于單核細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答及結(jié)核菌感染過程中有重要作用，因此肺結(jié)核患者單核細(xì)胞中miR-20a-5p分子的差異表達(dá)，可準(zhǔn)確反映感染結(jié)核菌后，機(jī)體出現(xiàn)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以，可將其視為診斷結(jié)核的潛在生物標(biāo)記，且也有可能被視為肺結(jié)核靶向治療的新靶點(diǎn)。

不過，本實(shí)驗(yàn)對(duì)患者miR-20a-5p分子的下調(diào)機(jī)制并未展開研究，因而對(duì)結(jié)核菌對(duì)單核細(xì)胞內(nèi)miR-20a-5p分子表達(dá)水平的影響機(jī)制尚不明晰。其次細(xì)胞凋亡是機(jī)體控制結(jié)核分枝桿菌感染的主要防御機(jī)制之一，結(jié)核病患者體內(nèi)miR-20a-5p分子表達(dá)降低是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)以及通過何種機(jī)制來促進(jìn)凋亡都是未知的，需進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20a-5p在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值，這些都是未來的研究方向。