楊國(guó)燦 劉 琪

(紹興市人民醫(yī)院，紹興312000)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是因長(zhǎng)期、大量飲用各種含酒精的飲料所致的肝臟損害性病變，主要表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纖維化3種形式[1,2]。酒精性肝病的致病因素單一，即長(zhǎng)期大量的酒精攝入。但其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的毒性作用、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、遺傳多態(tài)性等多種因素有關(guān)[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)是由20多個(gè)成員組成的、具有多種生物功能的一類細(xì)胞因子家族[4]。研究表明FGF-21具有內(nèi)分泌因子的功能，參與機(jī)體物質(zhì)代謝，維持機(jī)體脂肪和糖代謝的平衡[5]。本文旨在研究FGF-21對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 C57/6小鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)劉彥隆教授提供。TaqMan?Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher)；SuperScriptTMIII cDNA Kit(Invitrogen)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；TG kit(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；cDNA 第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)。

1.2方法

1.2.1建立ALD小鼠模型 根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，采用Lieber-DeCarli(PF)飲食配方和酒精(AF)的處理方法喂養(yǎng)C57/6小鼠4周，建立酒精性肝病模型。最后1周注射重組人FGF-21。頸椎脫臼處死小鼠，留取血清，各組小鼠血液中ALT和AST含量均在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)。取其肝臟組織待用。

1.2.2H&E染色觀察各組小鼠肝組織的病理學(xué)變化 肝組織于10%中性甲醛中固定，常規(guī)方法制作石蠟切片，撈片，烤片；常規(guī)脫蠟至水，并進(jìn)行蘇木素染液2 min，鹽酸酒精分化30 s，自來(lái)水返藍(lán)，伊紅染液1 min，蒸餾水洗3 min，乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，拍照，運(yùn)用Image-ProPlus6.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

1.2.3RNA抽提 應(yīng)用RNeasy Mini試劑盒提取動(dòng)物組織總RNA。所得RNA即可用于cDNA合成或-80℃短暫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4cDNA合成 應(yīng)用cDNA第一鏈合成試劑盒。反應(yīng)體系:50 μmol/L Oligo(dT)20 1 μl、10 mmol/L dNTP mix 1 μl、總RNA 7 μl、DEPC water 1 μl。輕輕混勻后離心3～5 s，于65℃水浴5 min后，冰上放置1 min，稍微離心后，加入10×RT buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl24 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase OUT 1 μl、SuperScript Ⅲ RT 1 μl。輕輕混勻后離心3～5 s，置于50℃水浴50 min；85℃水浴5 min 后，冰上放置1 min，短暫離心后，加入1 μl RNase H；置于37℃水浴20 min后，結(jié)束反應(yīng)，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)小鼠肝臟中PGC-1α的水平 使用TaqMan?Universal PCR Master Mix試劑盒，按照7900HT Real-Time PCR System建立反應(yīng)體系。內(nèi)參使用36B4，使用的引物序列如下:PGC-1α-F(5′-AATCAGACCTGACACAAACGC-3′)、PGC-1α-R(5′-GCATTCCTCAATTTCACCAA-3′)、36B4-F(5′-GCAGACAACGTGGGCTCCAAGCAGA-3′)、36B4-R(5′- GGTCCTCCTTGGTGAACACGAAGCCC-3′)。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s，95℃ 5 s，65℃ 20 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，分析Real-Time PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1脂肪變性及生化指標(biāo) H&E染色顯示酒精喂養(yǎng)組小鼠肝臟發(fā)生明顯的脂肪變性，而對(duì)照飲食組脂肪變性較輕(圖1A)。同時(shí)，酒精喂養(yǎng)組小鼠肝臟中TG的含量顯著高于對(duì)照飲食組(圖1B)。我們也檢測(cè)了各組小鼠血液中ALT和AST含量，酒精喂養(yǎng)組ALT和AST含量顯著增高(圖1C、D)。

2.2FGF-21降低酒精引起的肝臟脂肪堆積 H&E染色顯示酒精喂養(yǎng)組小鼠肝臟發(fā)生明顯的脂肪變性，而FGF-21注射組脂肪變性程度有所減輕(圖2A)。同時(shí)，F(xiàn)GF-21注射組小鼠肝臟TG的含量顯著低于酒精喂養(yǎng)組(圖2B)。

2.3小鼠肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活酶因子1α(PGC-1α)水平的檢測(cè) Real-Time PCR檢測(cè)小鼠肝臟中PGC-1α的水平，如圖3所示，酒精喂養(yǎng)組小鼠肝臟中PGC-1α的水平顯著高于對(duì)照飲食組。

圖1 兩組生化指標(biāo)和病理學(xué)變化Fig.1 Biochemical parameters and pathological changes of liver tissues were compared between two groupsNote: C57/6 mice fed with Lieber-DeCarli(PF) and alcohol(AF) for 4 weeks.A.H&E staining was used to examine the structure of the liver of each group of mice；B.The liver was collected and the kit was used to detect the TG content in the liver.Peripheral blood was collected and the kit was used to detect the levels of ALT(C)and AST(D) in plasma.*.P<0.05.

圖2 FGF-21對(duì)酒精引起的脂肪堆積的影響Fig.2 Effect of FGF-21 on alcohol-induced fat accumulationNote: C57/6 mice were fed a Lieber-DeCarli(PF) and alcohol(AF) diet for 4 weeks,and the AF group mice were injected with FGF-21(AF+FGF-21)for the last week.A.H&E staining was used to examine the structure of the liver of each group of mice；B.The liver was collected and the kit was used to detect the TG content in the liver.*.P<0.05.

圖3 Real-Time PCR檢測(cè)小鼠肝臟中PGC-1α的水平Fig.3 Real-Time PCR to detect the level of PGC-1α in mice liverNote: *.P<0.05.

3 討論

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高、生活方式的改變及飲食習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)酒精性肝病的患病率不斷增加，已成為肝病結(jié)構(gòu)中主要組成部分。酒精性肝病的致病因素單一，但其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。本文通過(guò)對(duì)比兩組小鼠病理和生化結(jié)果，并通過(guò)檢測(cè)小鼠肝臟中PGC-1α，探討FGF-21對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用及其機(jī)制。

Lilly公司的Kharitomenkov證實(shí)FGF-21可促進(jìn)小鼠3T3-L1細(xì)胞和前脂肪組織的葡萄糖吸收；FGF-21在過(guò)氧化物酶體增生物激活受體PPARα調(diào)節(jié)下，可以作為肝臟中穩(wěn)定的脂類調(diào)節(jié)劑，以避免脂肪肝的發(fā)生[7]。腺病毒誘導(dǎo)的FGF-21基因敲除小鼠循環(huán)系統(tǒng)中FGF-21的水平顯著降低，表現(xiàn)出迅速的脂肪堆積和明顯的脂質(zhì)紊亂。當(dāng)給予這種基因敲除小鼠高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)，小鼠可以發(fā)生嚴(yán)重的代謝紊亂，包括脂肪肝、高三酰甘油血癥、血中的自由脂肪酸和膽固醇的含量顯著增加以及血中酮體含量的減少[8]。有研究以C57BL/6J為背景的小鼠制作FGF-21轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該小鼠對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖具有明顯的抑制作用。該轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中FGF-21 mRNA的水平與對(duì)照組正常小鼠相比高出50～150倍，同時(shí)血中膽固醇、三酰甘油、血糖和胰島素的水平顯著降低。同時(shí)，小鼠血中β-羥丁酸的含量顯著增加，同時(shí)伴有脂肪組織減少，白色脂肪組織中脂肪酶含量顯著增加以及血中自由脂肪酸含量的增加[7]。

目前已有研究表明FGF-21與肝臟疾病存在一定關(guān)系。有人報(bào)道肝損傷患者外周血中FGF-21水平顯著增高并與谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)呈相關(guān)性[9]。最近三組研究幾乎同時(shí)報(bào)道了非酒精性脂肪肝患者體內(nèi)FGF-21水平顯著增高[10]，其中一組同時(shí)檢測(cè)了肝臟中FGF-21蛋白和mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FGF-21水平隨著肝脂肪變程度的增加而增高[11-14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有相似的結(jié)果，高脂流體飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟中FGF-21 mRNA顯著增高[15]?？傊?，F(xiàn)GF-21對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用，同時(shí)FGF-21是FGFs家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒(méi)有促有絲分裂活性的蛋白，從而大大降低了臨床用藥的風(fēng)險(xiǎn)。這些都表明了它在糖脂代謝性疾病上的治療效果，也預(yù)示了它在人體藥物開(kāi)發(fā)中具有重要的應(yīng)用前景。

PGC-1α是一種介導(dǎo)多種細(xì)胞能量代謝和核受體的重要因子，可以輔助激活一系列核受體基因的表達(dá)。它通過(guò)激活脂肪酸氧化、糖異生、線粒體呼吸的關(guān)鍵酶參與了脂代謝紊亂、胰島素抵抗、線粒體損傷的形成[16-19]。

綜上所述，給酒精性肝病小鼠注射重組人FGF-21可以顯著減輕肝臟的脂肪堆積，改善酒精對(duì)肝臟的損傷。PGC-1α可能在FGF-21對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用及其機(jī)制中發(fā)揮重要作用，我們將繼續(xù)研究FGF-21對(duì)酒精性肝病以及肝纖維化的藥理學(xué)作用，探討FGF-21是否可以逆轉(zhuǎn)酒精性肝病的發(fā)展過(guò)程，阻止酒精性肝硬化的發(fā)生。