羅 萍 杜娟娟 杜 松

(河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州450003)

細(xì)胞自噬是一種存在于真核生物中高度保守的代謝過(guò)程[1]。通過(guò)清除體內(nèi)異常的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，參與細(xì)胞物質(zhì)代謝平衡的調(diào)節(jié)[2]。細(xì)胞自噬在機(jī)體炎癥、免疫、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[3]。心血管疾病是引起人類死亡的最主要原因，患病的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡增長(zhǎng)而增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年有1 750萬(wàn)人死于心血管疾病，占全球死亡人數(shù)的30%以上[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在心血管系統(tǒng)中，正常的自噬對(duì)維持血管和心臟的穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要，然而自噬缺陷或過(guò)度自噬會(huì)造成心血管疾病的發(fā)生，如心力衰竭、心肌肥大和動(dòng)脈粥樣硬化[5]。晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)是糖尿病血管并發(fā)癥的一大特征[6]。AGEs及其受體相互作用，在體內(nèi)誘發(fā)氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎性反應(yīng)，加速心血管疾病的發(fā)生[7]。大量研究發(fā)現(xiàn)，AGEs通過(guò)損傷組織細(xì)胞，能顯著提高細(xì)胞自噬水平[8]。白樺脂醇是來(lái)源于白樺樹(shù)皮的一種羽扇烷型三萜類化合物。近年來(lái)，白樺脂醇在抗炎、抑菌、抗腫瘤和抗HIV等方面效果明顯，因而廣受關(guān)注[9,10]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇對(duì)受損的心肌具有保護(hù)作用[11]，但是白樺脂醇對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文使用AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬，探究白樺脂醇對(duì)細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 白樺脂醇(純度>98%，cas:473-98-3)購(gòu)自道斯夫生物；AGE-BSA(2221-10)購(gòu)自艾美捷科技有限公司；巴佛洛霉素A(Bafilomycin,Baf-A1)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰酶購(gòu)自Hyclone公司；盤尼西林(Penicillin)和鏈霉素(Streptomycin)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；CCK8試劑盒購(gòu)自默沙克生物；肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和心肌肌鈣蛋白(Myocardial troponin，cTnⅠ)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏；BCA試劑盒購(gòu)自北京天根生物；Beclin1、P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT兔抗大鼠一抗和羊抗兔二抗及顯影液購(gòu)自美國(guó)Abcam；H9C2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 H9C2細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM+10%FBS+100 U/ml盤尼西林+100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞隨機(jī)分成正常H9C2組，AGEs組(100 mg/L)，低劑量加藥組(5 μmol/L)，中劑量加藥組(10 μmol/L)，高劑量加藥組(20 μmol/L)。

1.2.2CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2心肌細(xì)胞，消化后，離心棄上清，用培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，96孔板中加100 μl 細(xì)胞懸液。同時(shí)加入不同相應(yīng)濃度白樺脂醇和(或)AGEs，空白組使用不加藥物的溶液。培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)24 h，加入10 μl CCK8。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 收集H9C2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加細(xì)胞裂解液，超聲后破碎，12 000 r/min離心15 min，收集上清備用?？贵w包被反應(yīng)孔，加稀釋后的待檢測(cè)樣品，設(shè)置空白組和對(duì)照組，置于37℃孵育1 h。加入稀釋后的酶標(biāo)抗體，37℃孵育1 h；加底物于37℃反應(yīng)15 min后，終止反應(yīng)。以空白組調(diào)零后，酶標(biāo)儀下檢測(cè)450 nm處光吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶的含量。

1.2.4Western blot 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，稀釋后接種于含AGEs和(或)不同濃度的白樺脂醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后。收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液處理H9C2細(xì)胞。BCA法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度，制備蛋白樣品。等量蛋白樣品經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min，室溫下孵育二抗1 h，TBST洗膜后加顯色液顯影。凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照，使用Image-pro plus軟件分析蛋白條帶灰度。

1.2.5免疫熒光染色 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗；用PBS配制的0.5% Triton X-100室溫下通透20 min。山羊血清室溫封閉30 min；除去封閉液，加稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBST清洗，加稀釋好的帶熒光標(biāo)簽的二抗，室溫下孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，用PBST清洗除去DAPI，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5分析數(shù)據(jù)和作圖。數(shù)據(jù)是3次實(shí)驗(yàn)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。兩組之間的差異用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1白樺脂醇促進(jìn)AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞的活性 AGEs組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯低于正常H9C2組(圖1，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖倍數(shù)顯著升高，且增殖倍數(shù)隨著白樺脂醇濃度的增加而升高(圖1，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白樺脂醇促進(jìn)AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞的活性。

2.2白樺脂醇對(duì)心肌酶表達(dá)的影響 ACEs組與H9C2組相比較，細(xì)胞中Mb、CK-MB和cTnⅠ的表達(dá)顯著上升(圖2，P<0.01)。將白樺脂醇與ACEs共同作用于H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞中Mb、CK-MB和cTnⅠ的表達(dá)明顯下降；且白樺脂醇的濃度越高，降低的效果越明顯(圖2，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白樺脂醇抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。

2.3白樺脂醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 正常H9C2經(jīng)AGEs處理后，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Beclin1的表達(dá)顯著上調(diào)，P62的表達(dá)顯著下調(diào)，LC3Ⅱ的表達(dá)上調(diào)，使LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比率顯著上升，提示細(xì)胞自噬水平升高(圖3A，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2細(xì)胞后，Beclin1表達(dá)顯著下調(diào)，P62表達(dá)顯著上調(diào)，而LC3Ⅱ的下調(diào)和LC3Ⅰ的上調(diào)，使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ顯著下降(圖3A，P<0.01)。向上述各組細(xì)胞中加入巴佛洛霉素A1，檢測(cè)結(jié)果顯示，AGEs組與H9C2組相比，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ顯著上升；不同濃度白樺脂醇處理細(xì)胞后，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ顯著降低(圖3C，P<0.01)，且上述作用均具有白樺脂醇劑量依賴效應(yīng)。

2.4白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞自噬體的形成 免疫熒光染色結(jié)果顯示，AGEs處理H9C2心肌細(xì)胞后，LC3光點(diǎn)呈現(xiàn)團(tuán)狀，光點(diǎn)數(shù)目顯著上升，表明有大量自噬體形成(圖4，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同處理H9C2細(xì)胞后，LC3光點(diǎn)隨著白樺脂醇濃度的增加而顯著減少(圖4，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞自噬體的形成。

圖1 白樺脂醇對(duì)心肌細(xì)胞細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of Betulin on activity of myocardial cellsNote: Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group，##.P<0.01.

圖2 白樺脂醇抑制AGEs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)作用Fig.2 Betulin inhibits H9C2 myocardial cell injury induced by AGEsNote: Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group，##.P<0.01.

2.5白樺脂醇抑制AGEs作用下H9C2細(xì)胞PI3K和AKT的活化 AGEs處理H9C2細(xì)胞后，PI3K和AKT蛋白總量未見(jiàn)明顯變化，p-PI3K 和p-AKT則顯著上升，使p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著提高(圖5，P<0.01)。白樺脂醇與AGEs共同作用于H9C2心肌細(xì)胞后，PI3K和AKT蛋白總量沒(méi)有明顯變化，p-PI3K和p-AKT的含量隨著白樺脂醇濃度的增加而降低，使p-PI3K和p-AKT在細(xì)胞中占比顯著下降(圖5，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白樺脂醇降低PI3K和AKT的磷酸化水平，在起始階段抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞自噬。

圖3 白樺脂醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Betulin on expression of autophagy related proteinsNote: A and B.Effects of betulin on Beclin1,P62 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ without the addition of Bafilomycin A1;C and D.Eeffects of betulin on LC3Ⅱ/LC3Ⅰ in the presence of Bafilomycin(200 nmol/L).Compared with the H9C2 group，**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

圖4 免疫熒光檢測(cè)LC3的表達(dá)Fig.4 Expression of LC3 was determined by immunofluorescenceNote: Compared with the H9C2 group,**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

圖5 白樺脂醇對(duì)AGEs作用下H9C2細(xì)胞PI3K,AKT表達(dá)及其磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of Betulin on expression and phosphorylat-ion level of PI3K and AKT in AGEs treated H9C2 cellsNote: Compared with the H9C2 group,**.P<0.01;compared with the AGEs group,##.P<0.01.

3 討論

細(xì)胞自噬的是一種溶酶體降解途徑，對(duì)生存、分化、發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[12]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬在許多疾病如感染、神經(jīng)退行性疾病、癌癥中起到保護(hù)作用[3,13]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞自噬水平發(fā)生異常時(shí)，會(huì)誘發(fā)多種疾病，如細(xì)胞自噬減弱與阿爾茲海默癥的發(fā)生密切相關(guān)[14,15]。生長(zhǎng)因子、細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平、葡萄糖水平、DNA損傷、氧自由基等均可引起細(xì)胞自噬水平的變化。白樺脂醇是一種具有多種生物活性的天然提取物。大量研究顯示，許多天然藥物能促進(jìn)細(xì)胞的增殖速率，如Lai等[16]發(fā)現(xiàn)，原花青素能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)Th17和Treg細(xì)胞增殖，從而治療銀屑病。本文研究結(jié)果顯示，白樺脂醇能提高AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞的活性。

當(dāng)AGEs在體內(nèi)含量異常升高時(shí)，會(huì)損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)白細(xì)胞黏附和血小板數(shù)量增加，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥，嚴(yán)重?fù)p害心血管系統(tǒng)。當(dāng)心肌受到損傷時(shí)，心肌酶譜系列酶的濃度會(huì)有不同程度的升高，因而心肌酶譜常用來(lái)檢測(cè)心肌損傷的情況，對(duì)心肌梗死的診斷具有參考價(jià)值。Mb、CK-MB和cTnⅠ是常見(jiàn)的心肌損傷標(biāo)記物。許多研究證實(shí)，白樺脂醇能降低心肌組織中CK的表達(dá)。如Xia等[17]的研究結(jié)果顯示，白樺脂醇能降低乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(Creatinekinase,CK)的活性，對(duì)心肌缺血再灌注大鼠具有保護(hù)作用。與前面研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，白樺脂醇能降低AGEs作用下H9C2心肌細(xì)胞Mb、CK-MB和cTnⅠ的濃度，緩解AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞自噬是一個(gè)多基因參與的高度保守的復(fù)雜過(guò)程。Beclin1、P62和LC3是自噬發(fā)生過(guò)程中的3個(gè)重要蛋白。Beclin1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源基因，在自噬的起始階段通過(guò)招募其他自噬相關(guān)基因形成復(fù)合物，介導(dǎo)其定位于自噬泡，調(diào)控自噬的起始[18,19]。LC3作為自噬標(biāo)記物，在自噬體膜延伸階段，LC3Ⅰ經(jīng)過(guò)酶切轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ,LC3Ⅱ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合后,定位于自噬體膜上[20]。P62與LC3形成復(fù)合體，隨著自噬的發(fā)生被降解，因此細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和P62的含量作為自噬發(fā)生的標(biāo)志物[21]。Lin等[22]研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇在小鼠體內(nèi)具有鎮(zhèn)痛、降低炎性反應(yīng)的作用，同時(shí)抑制自噬水平。本研究結(jié)果顯示，白樺脂醇添加到AGEs處理的H9C2心肌細(xì)胞后，Beclin1表達(dá)下調(diào)，P62含量上升，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下降，提示白樺脂醇可能會(huì)抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞自噬。

細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，先形成一個(gè)杯狀的前自噬體，吞噬聚集的蛋白和受損的細(xì)胞器，隨后閉合成完整的自噬體，自噬體與溶酶體融合后，內(nèi)容物在溶酶體作用下消化。正常生理狀態(tài)下，LC3在胞質(zhì)中呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3Ⅱ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合定位于自噬體膜[23]。通過(guò)免疫熒光染色，根據(jù)熒光顆粒的聚集程度和分布，不僅反映出細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)情況，還能判斷細(xì)胞自噬發(fā)生的狀態(tài)。免疫熒光檢測(cè)LC3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白樺脂醇能抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞自噬體的形成。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，通過(guò)激活A(yù)KT從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)[24,25]。大量研究證實(shí)，白樺脂醇對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。如Jin等[26]發(fā)現(xiàn)，從黃蓮根中提取的白樺脂醇通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，能夠抑制甲基黃嘌呤誘導(dǎo)的黑色素的生成。Majeed等[27]發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路從而抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散。Ci等[28]研究表明，白樺脂醇通過(guò)調(diào)節(jié)AKT依賴的信號(hào)通路從而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。本文研究結(jié)果表明，白樺脂醇可能抑制AGEs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞PI3K和AKT的磷酸化激活作用。

綜上所述，白樺脂醇能促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖，下調(diào)Beclin1的表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞自噬，緩解心肌細(xì)胞的損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的活化有關(guān)。下一步研究將探討白樺脂醇在大鼠心肌梗死模型中對(duì)細(xì)胞自噬及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。