(河南師范大學水產學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

魚和漁業(yè)產品能夠提供維持人體健康的蛋白質和必須微量元素，對維持人體營養(yǎng)均衡有重要意義。水產養(yǎng)殖已成為增加魚類供應的主要途徑和動物食品中增加最快的行業(yè)[1]。2018年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒的數(shù)據(jù)顯示：淡水養(yǎng)殖的水產品占淡水產品產量的93.01%，淡水養(yǎng)殖面積占水產養(yǎng)殖總面積的72.02%。其中池塘養(yǎng)殖面積最大，占總的淡水養(yǎng)殖面積的47.12%。因此，在我國，池塘養(yǎng)殖是一種重要的淡水養(yǎng)殖形式。

池塘養(yǎng)殖中，一個健康的藻相尤其重要，藻相的形成和變化主要由浮游生物，特別是浮游植物的變動引起[2]。健康的池塘藻相主要含硅藻和綠藻[3]。但是由于集約化養(yǎng)殖，過量投喂，管理不科學等，養(yǎng)殖水體出現(xiàn)嚴重的富營養(yǎng)化，導致水體中藻相失衡。浮游植物的群落組成變成藍藻成為優(yōu)勢種群。目前有毒藍藻引起的水華會引發(fā)很多問題。在養(yǎng)殖池塘中后期容易爆發(fā)有害藍藻水華，首先會破壞池塘藻相結構，抑制有益藻類生存，破壞池塘的生態(tài)平衡。其次，藍藻門微囊藻屬的一些藻類大量繁殖會產生毒素。長期暴露于微囊藻毒素的環(huán)境中不僅使養(yǎng)殖的水產生物減產，而且會嚴重影響人類健康，容易導致肝癌、結腸癌、直腸癌等[4-5]。藍藻產生的某些次生代謝產物被魚蝦吸收到體內積累，破壞口感，影響魚蝦的使用價值。

目前常用的幾種治理策略包括物理方法[6]、化學方法[7]和生物方法[8]來調控池塘藻相。常用的物理方法有更換池塘中的水，保證水體干凈；多開增氧機來增加水體的流動；也可潑灑一些試劑使藻類絮凝；或者直接人工將水體的藻類打撈出來。物理方法工作量大，成本高?；瘜W方法主要是使用殺藻劑如硫酸銅、漂白粉、石灰等，近些年也有一些綜合性的除藻劑被使用。化學方法見效快，成本低，但往往會給水體帶來新的污染。生物方法主要有放養(yǎng)一些以藍藻為食的濾食性魚類[9]；向水體投放復合微生物來降解水體中的污染物。生物方法常常局限性比較大，而且部分生物會帶來生物入侵?？傊?，亟待找到一種綠色、高效的藻華治理方法。

緩解藍藻水華的另一種方法是基于化感作用在靜水或富營養(yǎng)化水體中使用植物作為殺藻劑?；凶饔檬侵参锘蛘呶⑸锂a生化學物質并釋放出，對其他生物產生直接或間接的影響。蘆葦[10]、鳳眼蓮[11]、穗花狐尾藻[12]等水生植物，稻草[13]、大麥秸稈[14]等陸生植物對緩解有害藻華藻種有一定效果。我們前期比較馬齒莧（Portulaca oleracea）、吊蘭（Chlorophytum comosum）、野菊花（Chrysanthemum indicum）、長壽花（Kalanchoe blossfeldiana）、蘆薈（Aloe vera）和綠蘿（Epipremnum aureum）6種常見陸地植物的抑藻效果，發(fā)現(xiàn)野菊花對銅綠微囊藻的抑制作用最強。為了進一步探討野菊花抑藻的活性成分，本實驗比較不同浸提時間對野菊花抑制銅綠微囊藻效果的影響，為下一步應用野菊花控制藍藻水華提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

實驗材料：一株中國科學院淡水藻種庫分離出的純培養(yǎng)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ，F(xiàn)ACHB-905）。使用的野菊花花蕾產自大別山。

實驗儀器：電子天平（500 g/0.01 g），高速離心機（TG16-WS），生物顯微鏡（MoticBA210），恒溫光照培養(yǎng)箱（MGC-800BP-2）。

1.2 野菊花水浸提液制備

使用天平稱取5份20.00 g的野菊花，加到250 mL的錐形瓶中，然后分別向錐形瓶中加入125 mL蒸餾水，輕輕搖動，使所有野菊花花蕾浸入到蒸餾水中，制備成濃度為160.00 g/L的母液。設置的浸提時間分別為2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。室內自然水溫（16℃）浸提到指定時間后，8000 r/min離心10 min后收集菊花母液，放入帶蓋玻璃管中，-20℃低溫保存。

1.3 控藻實驗

將處于指數(shù)增長期的藻種接種到新配置的無菌BG11培養(yǎng)液中，保證初始藻的光密度OD650為0.03（細胞密度7.81×105cells/mL），分別加入不同浸提時間的野菊花母液5 mL（實驗體系中野菊花濃度8 g/L），對照組加入5 mL的滅菌純水。為每個實驗組設置3個平行。將處理后裝有藻液的錐形瓶放在溫度25℃，光照強度是2000lx并且光暗比12:12的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天手動搖動三次，培養(yǎng)3d后取樣，將1 mL的樣品用魯哥氏液固定，顯微鏡下計數(shù)。

1.4 指標測定

使用浮游植物計數(shù)框（0.1 mL），在Motic BA210生物顯微鏡40倍下分別觀察記錄20個視野的細胞數(shù)，得到藻細胞密度（A），并根據(jù)以下公式計算銅綠微囊藻細胞日增長率（μ）和抑制率（IR）[15]：μ(/d)=ln(A3/A0)/3，IR(%)=100×(μC-μT)/μC，其中，A3和A0是每個樣品實驗結束（day3）和開始（day0）時的細胞密度，μC和μT分別為對照和處理中銅綠微囊藻細胞日增長率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每個樣品中的藻細胞密度數(shù)據(jù)以平均值±標準差顯示。使用Microsoft Excel 2010，統(tǒng)計3d后的藻細胞密度，計算其日增長率，野菊花水浸提液的抑制率。用SPSS Statistics v22的單因素方差分析，分析不同浸提時間下得到的野菊花水浸提液對銅綠微囊藻的影響是否有顯著性差異。

2 結果

2.1 銅綠微囊藻細胞數(shù)變化

為探討野菊花水浸提液對銅綠微囊藻的影響，設置2 h、4 h、8 h、12 h和24 h的浸提時間浸提等量野菊花。暴露在不同浸提時間得到的野菊花水浸提液72 h后，經過處理的銅綠微囊藻細胞數(shù)都顯著低于沒有經過處理的組（p＜0.05）。并且銅綠微囊藻的細胞數(shù)隨著浸提時間增加而減幅越大，通過單因素方差分析的結果可以看出，2 h與4 h間差異不顯著但是與8 h、12 h、24 h有顯著性差異（p＜0.05）。而且經過8h野菊花水浸提液處理的與12 h和24 h間沒有顯著性差異（p ＞0.05，圖1）。

2.2 基于銅綠微囊藻細胞日增長率的抑制率

圖1 不同浸提時間野菊花水浸提液對銅綠微囊藻細胞數(shù)的影響Fig.1 Effects of water extract of C.indicum cell concentrations of M.aeruginosa under different extraction time.Different letters indicate significant differences among treatments(p＜0.05)

不同浸提時間野菊花水浸提液對銅綠微囊藻細胞的抑制率，統(tǒng)計結果如表1。結果顯示，2 h的浸提處理，藻細胞的比生長率最大，為0.16/d，12 h，24 h處理時，比生長率變成了負值，是-0.03/d，-0.05/d。浸提24 h有最高的抑制率為116.09%。

3 討論

表1 野菊花水浸提液對銅綠微囊藻細胞增長的抑制率比較Table 1 Comparison of the growth inhibition rate of C.indicum water extracts on cell increase of M.aeruginosa

菊科是一種自然界里廣泛分布的植物，并且菊科植物化學成分的多樣性、復雜性遠高于其他植物，其藥用功效的研發(fā)和應用已有較大進展[16]，在園林景觀等方面也有持久地發(fā)展[17]。前期已有研究發(fā)現(xiàn)菊科植物中有39個屬存在明顯的化感作用[18]。其中菊科植物中被明確鑒定出的能夠對受體植物起到抑制或促進作用的化感物質常是有機酸類、酚類、萜類等[1 9]。但是，菊科植物對有害藍藻影響方面的研究還較少，目前發(fā)現(xiàn)三種菊科植物[20-21]對銅綠微囊藻有一定的抑制效果。我們的前期調查發(fā)現(xiàn)野菊花也有較強的抑藻效果，但仍不清楚其有效抑藻活性成分或物質。本研究通過野菊花水浸提液抑藻實驗，發(fā)現(xiàn)部分抑藻活性成分或物質應具有水溶性特征，這為我們下一步純化活性組分和分離活性物質打下了基礎。

浸提時間的選擇影響到物質的溶出程度和浸提效率。沈潔采用24 h對檉柳花（Tamarix chinensis Lour）進行水浸提[22]。劉紅云選擇48 h對貓爪草（Ranunculi ternati）種子進行水浸提并研究其對三種植物的影響[23]。慕小倩等人選擇72 h浸提得到10種菊科植物的水浸提液，研究其對小麥幼苗的化感作用[24]。但是不同浸提時間的比較研究卻很少。本研究發(fā)現(xiàn)，對野菊花水浸提液最為有效的浸提時間為8h，遠低于現(xiàn)有報道中所采用的水浸提液浸提時間，將顯著提高浸提液制備效率，有助于后續(xù)對野菊花有效抑藻成分的純化和活性物質的分離鑒定，也為其他植物源活性物質的研發(fā)提供了方法上的參考。