羅赤星 全中平 張 銘 周 波 王少波 羅心凱 黃義志

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，且呈逐年上升趨勢[1]。腦膠質(zhì)瘤患者目前治療主要采用手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療等綜合治療，但大部分患者首次治療后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的主要原因在于腫瘤細(xì)胞不能完全手術(shù)清除，復(fù)發(fā)部位多在原部位，復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后極差，平均生存期1.0～4.5個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)為死亡主要原因，及時(shí)進(jìn)行外科手術(shù)再切除為首選治療方案，是減少腫瘤細(xì)胞最快最有效的方法，可減輕顱內(nèi)壓迫癥狀，為后續(xù)治療創(chuàng)造條件[2～4]。

研究表明血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)參與腫瘤的局部浸潤，是評(píng)估腫瘤患者病情及預(yù)后的重要指標(biāo)，在人腦膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度與腦膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)[5，6]。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，BMP)除促進(jìn)骨和軟骨生成，在腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲過程也發(fā)揮重要作用，且與腦惡性腫瘤關(guān)系密切[7]。VEGF、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-2，BMP-7)蛋白在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)如何，對(duì)臨床治療預(yù)后意義如何，成為臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究通過分析比較72例腦膠質(zhì)瘤患者原發(fā)和復(fù)發(fā)術(shù)后瘤組織VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白的表達(dá)情況與臨床病理資料之間的關(guān)系，為該疾病診斷、治療、預(yù)后、評(píng)估提供依據(jù)，現(xiàn)總結(jié)歸納報(bào)道如下。

資料與方法

1.一般資料：選擇筆者醫(yī)院神經(jīng)外科2012年1月～2015年1月收治的72例復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者行手術(shù)治療，首次手術(shù)及復(fù)發(fā)后再手術(shù)均在筆者醫(yī)院完成，有完整臨床病理資料。其中男性44例，女性28例；患者年齡28～69歲，平均年齡45.3±11.9歲；72例患者原發(fā)病灶術(shù)后按照WHO CNS 2016病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)31例，Ⅳ級(jí)19例，復(fù)發(fā)后病灶Ⅰ級(jí)0例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)34例，Ⅳ級(jí)31例[8]。所有患者均為原位復(fù)發(fā)，病灶位于額葉12例，顳葉11例，枕葉8例，額頂葉9例，額顳葉7例，顳頂葉10例，四腦室7例，其他部位8例。按病理類型分為星形細(xì)胞瘤17例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤15例，少枝星形細(xì)胞瘤18例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤22例，復(fù)發(fā)術(shù)后病理性質(zhì)未發(fā)生改變。首次術(shù)后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)5例，1年內(nèi)復(fù)發(fā)19例，2年內(nèi)復(fù)發(fā)35例，3年內(nèi)復(fù)發(fā)13例，最短復(fù)發(fā)時(shí)間4.2個(gè)月，最長復(fù)發(fā)時(shí)間31.5個(gè)月，平均15.3±4.7個(gè)月。

2.試劑與儀器:兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人BMP-2多克隆抗體、兔抗人BMP-7多克隆抗體、Ⅰ抗試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；JEDR801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)Version6.0購自捷達(dá)科技有限公司等。

3.免疫組化方法：按照試劑盒說明書，將所有患者瘤組織標(biāo)本10%甲醛溶液常規(guī)固定、石蠟包埋、4μm切片；切片后二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，再自然冷卻。3%H2O237℃ 孵育，5%正常山羊血清37℃封閉，加Ⅰ抗(50μl)，冰箱4℃過夜。次日復(fù)溫，加Ⅱ抗，滴加SABC液，DAB顯色5min，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，再烤干。所有標(biāo)本均在同一條件下采用免疫組化SABC方法進(jìn)行染色，均設(shè)PBS液陰性和陽性對(duì)照。在各病理組織內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400倍)，染色以胞膜、胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色沉淀物為陽性表達(dá)。

4.免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：在光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色顆粒為VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，按照Kraj ewska法進(jìn)行半定量分析：在高倍鏡(×400)下隨機(jī)抽取 10個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞率并分級(jí)：0級(jí)：計(jì)數(shù)比率<5%；1級(jí)：比率5%～25%；2級(jí)：比率25%～50%；3級(jí)：比率50%～75%；4級(jí)：比率>75%[9]。染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：陰性：0級(jí)；1 級(jí)：弱陽性；2級(jí)：陽性；3級(jí)：強(qiáng)陽性。最后，以陽性細(xì)胞率分級(jí)×染色強(qiáng)度分級(jí)/2≥0.5 判斷為免疫組化陽性表達(dá)。

5.隨訪生存：所有患者自復(fù)發(fā)后再次手術(shù)病理確診時(shí)開始隨訪，由專人通過電話、微信、QQ等方式聯(lián)系，無失聯(lián)病例，隨訪截止日期2018年3月1日，隨訪時(shí)間最短者3個(gè)月，最長者37個(gè)月。

結(jié) 果

1.可能影響VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)因素：對(duì)臨床病理資料采用Spearman等級(jí)分析，結(jié)果顯示，VEGF蛋白表達(dá)與性別、年齡、病理類型等資料不具有相關(guān)性，與WHO病理分級(jí)(rVEGF=0.375，P<0.05)及原發(fā)、復(fù)發(fā)(rVEGF=0.319，P<0.05)情況相關(guān)。BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)與性別、年齡、病理類型、WHO病理分級(jí)不具有相關(guān)性，與原發(fā)、復(fù)發(fā)(rBMP-2=0.492，P<0.05；rBMP-7=0.381，P<0.05)情況有關(guān)，詳見表1。

表1 VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

2.VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在原發(fā)及復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及分析：免疫組化結(jié)果顯示，VEGF 蛋白陽性表達(dá)主要集中在膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)中，在原發(fā)、復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤表達(dá)分別為52.8%(38/72)、68.1%(49/72)。BMP-2、BMP-7蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫性分布的棕黃色顆粒，強(qiáng)弱不等，在原發(fā)腦膠質(zhì)瘤表達(dá)分別為61.1%(44/72)、59.7%(43/72)，在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤表達(dá)分別為70.8%(51/72)、69.4%(50/72)，PBS陰性對(duì)照無黃色顆粒沉積，詳見表2和圖1。

表2 VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在原發(fā)及復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)[n(%)]

圖1 腦膠質(zhì)瘤患者VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白免疫組化表達(dá)(SABC,×400)A.VEGF蛋白表達(dá)；B.BMP-2蛋白表達(dá)；C.BMP-7蛋白表達(dá)；D.PBS陰性對(duì)照

3.VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)與隨訪關(guān)系：通過對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)術(shù)后隨訪統(tǒng)計(jì)分析，VEGF蛋白49例陽性表達(dá)者無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)為6.5±2.1個(gè)月，總生存期(overall survival，OS)為11.6±3.9個(gè)月；23例陰性表達(dá)PFS為8.9±2.8個(gè)月，OS為14.1±4.5個(gè)月。BMP-2蛋白51例陽性表達(dá)者PFS為5.9±1.9個(gè)月，OS為10.8±3.7個(gè)月；21例陰性表達(dá)PFS為8.2±2.6個(gè)月，OS為14.0±4.6個(gè)月。BMP-7蛋白50例陽性表達(dá)者PFS為5.2±1.6個(gè)月，OS為10.1±3.5個(gè)月；22例陰性表達(dá)PFS為7.9±2.2個(gè)月，OS為13.5±4.2個(gè)月。VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達(dá)PFS及OS均短于陰性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

腦膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)最常見原發(fā)惡性腫瘤，具有無控增殖，侵襲性生長，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，本質(zhì)上是一種多基因疾病，由于原癌基因過度表達(dá)，抑癌基因突變?nèi)笔?，?dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避正常生長調(diào)控機(jī)制，在此發(fā)病過程與多種細(xì)胞因子有關(guān)[10，11]。其中VEGF是一種具有分泌特點(diǎn)的外分泌蛋白，其家族成員有VEGF-A、PLGF、svVEGF，VEGF-A是通常所說的VEGF，作用最強(qiáng)，可以與特定的受體結(jié)合，激活多種信號(hào)通路，促進(jìn)血管通透性增加，腫瘤新生血管形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞遷移[12～14]。正常人體也會(huì)含有VEGF，可促進(jìn)組織和器官發(fā)育，腫瘤組織中過度表達(dá)，過度表達(dá)的VEGF與其相應(yīng)的受體特異性結(jié)合，誘發(fā)腫瘤血管生成，持續(xù)和廣泛的新生血管滿足了腫瘤細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)成分，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和侵襲性生長，加速腫瘤發(fā)展[15]。VEGF是促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，直接參與誘導(dǎo)腫瘤血管生成，已有多數(shù)研究證實(shí)VEGF表達(dá)程度與惡性程度密切相關(guān)[16，17]。

BMPs約有40多個(gè)家族成員，其中除了BMP-1為骨生長新的調(diào)節(jié)因子，屬于金屬鈦內(nèi)切酶家族(the astacin family of metalloen-dopeptidases)之外，其余BMPs均屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，BMPs家族成員有4個(gè)亞組，包括BMP-2、BMP-3、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-12、BMP-13、BMP-14等，其中BMP-2、BMP-7的研究較早也較為重要，近年來，大量研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中可檢測到BMP-2和BMP-7的陽性表達(dá)，逐步認(rèn)識(shí)到在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[18]。

本研究通過免疫組化法檢測筆者醫(yī)院經(jīng)手術(shù)確診的腦膠質(zhì)瘤患者原發(fā)和復(fù)發(fā)標(biāo)本，通過統(tǒng)計(jì)分析患者一般臨床病理資料，VEGF蛋白表達(dá)水平與性別、年齡、病理類型等臨床病理資料不具有相關(guān)性，與WHO病理分級(jí)(rVEGF=0.375)、原發(fā)或復(fù)發(fā)情況(rVEGF=0.319)具有相關(guān)性，而BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)水平與性別、年齡、病理類型、病理分級(jí)等臨床病理資料不具有相關(guān)性，與原發(fā)或復(fù)發(fā)(rBMP-2=0.492，rBMP-7=0.381)情況具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過Spearman等級(jí)資料分析結(jié)果提示，WHO病理分級(jí)和原發(fā)復(fù)發(fā)情況是VEGF蛋白表達(dá)的影響因素，原發(fā)復(fù)發(fā)情況是BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)的影響因素。進(jìn)一步研究分析，VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表達(dá)水平在復(fù)發(fā)患者中表達(dá)水平明顯高于原發(fā)患者，提示可作為易復(fù)發(fā)患者的判定指標(biāo)。通過隨訪分析，VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白陽性表達(dá)PFS及OS均短于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此還可作為高表達(dá)患者預(yù)后不良的判定指標(biāo)。

綜上所述，VEGF、BMP-2、BMP-7在復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者中高度表達(dá)，參與腦膠質(zhì)瘤的生長浸潤過程，可以作為判定腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，還可作為腫瘤分子標(biāo)志物，對(duì)于腦膠質(zhì)瘤患者個(gè)體化治療及判斷患者預(yù)后提供指導(dǎo)意義。