牟曉月 張幽幽 陶海英 金 都

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)一種慢性、進行性、對稱性多關(guān)節(jié)破壞為特征的全身性自身免疫病，以滑膜炎為主要病理改變，其發(fā)病機制尚不清楚，我國的發(fā)生率約為0.34%～0.36%，中年女性是高危人群[1]。早期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫及功能障礙，如果不能及時和正規(guī)治療，發(fā)病2年左右后約有一半患者發(fā)生關(guān)節(jié)畸形，甚至隨著病情的進展可以致殘[2]。RA患者的平均壽命可以減少5～10年，其死亡的首要原因是心血管疾病，有將近50%的RA患者死于心血管疾病[3，4]。國外研究發(fā)現(xiàn)，RA患者患動脈粥樣硬化的風(fēng)險高于正常人群，癥狀較為隱匿，常無心絞痛癥狀[5]。目前國內(nèi)對這一病變研究還相對較少。RA以局限性或系統(tǒng)性慢性炎癥為特點，而動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)也是動脈內(nèi)膜的慢性炎癥，RA和動脈粥樣硬化之間可能存在密切聯(lián)系。因此，借助慢性炎癥這一共同橋梁，研究RA患者中動脈粥樣硬化的發(fā)生炎癥機制，對RA患者動脈粥樣硬化預(yù)防和治療具有重要意義。叉頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead transcription factor 3,Foxp3)是特異性表達于調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)內(nèi)的標(biāo)志性分子，在免疫耐受和免疫抑制效應(yīng)中發(fā)揮決定性作用[6]。轉(zhuǎn)化生子因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要意義，參與了組織修復(fù)、細胞周期調(diào)節(jié)，同時也具有免疫抑制的作用[7]。因此，本研究通過探討RA患者外周血Foxp3和TGF-β1表達及與動脈粥樣硬化關(guān)系，為RA患者動脈粥樣硬化預(yù)防和治療提供一個新的思路。

資料與方法

1.一般資料：選取2016年1月～2018年5月在筆者醫(yī)院收治確診為RA的患者126例作為RA組，其中男性20例，女性106例，患者年齡26～64歲，平均年齡48.07±16.31歲。根據(jù)超聲檢查頸動脈內(nèi)膜中層厚度(inteima-media thickness，IMT)，IMT<0.9mm表示正常，0.9mm≤IMT≤1.3mm提示內(nèi)膜增厚，IMT>1.3mm表示有動脈斑塊，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將RA組分為RA有斑塊組62例和RA無斑塊組64例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合美國風(fēng)濕協(xié)會(American Rheumatism Association，ARA)1987年修訂的關(guān)于RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②本研究征得研究對象及家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他自身免疫性疾病患者；②半年內(nèi)使用激素或免疫抑制劑治療患者；③明確有心血管疾病患者；④嚴(yán)重肝臟、腎臟疾病和腫瘤患者。同時選擇筆者醫(yī)院健康體檢志愿者62例作為正常對照組，其中男性8例，女性54例，年齡22～60歲，平均年齡45.57±19.18歲。本研究獲得臺州市第一人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

2.病史及標(biāo)本采集：收集所有研究對象的身高、體重，計算體重指數(shù)(body mass index，BMI)，記錄RA組患者的病程、既往史，進行全身體格檢查，用2處關(guān)節(jié)炎疾病活動分數(shù)(disease activity score 28，DAS28)計算器計算DAS28評分。采集清晨空腹靜脈血8ml，分兩管，第1管加入TRIzol 1ml后-80℃保存?zhèn)溆?；?管分離血清后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.生化指標(biāo)的檢測：取出-80℃保存的血清，用全自動生化分析儀測定總膽固醇 (total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)水平。

4.用酶聯(lián)吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清中TGF-β1水平：將一抗稀釋至10μg/ml，加入到96孔板中，0.1毫升/孔，4℃過夜，洗滌3次，加血清0.1ml于上述反應(yīng)孔中，37℃孵育1h；加入0.1ml二抗，孵育1h；加入顯色液0.1ml，顯色20min；加入0.05ml濃度為2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，在450nm處測各孔吸光度(A)值。TGF-β1試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

5.用實時熒光RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)檢測外周血Foxp3 mRNA的表達：取處-80℃保存的加TRIzol全血，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書提取RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。條件為95℃ 30s預(yù)變性、95℃ 5s變性、60℃ 44s、40個循環(huán)，61℃時采集熒光，用實時熒光定量PCR儀檢測對其表達量進行結(jié)果分析，以GADPH作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計算mRNA 的相對表達量。

6.IMT超聲檢查：用多普勒彩色超聲顯像儀對所有研究對象進行IMT檢測，分別測量左右兩測頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸動脈分叉部的IMT，取平均值。IMT測量與資料采集的同一天完成。采用雙盲法，由經(jīng)驗豐富的超聲醫(yī)生進行檢測。

結(jié) 果

1.3組研究對象基本資料的比較：3組研究對象的年齡、BMI與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；RA無斑塊組和RA有斑塊組研究對象的TC、TG、LDL高于正常對照組，HDL低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RA有斑塊組研究對象的TC、TG、LDL高于RA無斑塊組，HDL低于RA無斑塊組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 3組研究對象基本資料的比較

與正常對照組比較，*P<0.05；與RA無斑塊組比較，#P<0.05

2.3組研究對象TGF-β1和Foxp3水平的比較：RA無斑塊組和RA有斑塊組研究對象血清中TGF-β1水平和Foxp3 mRNA的相對表達量低于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RA有斑塊組研究對象血清中TGF-β1水平和Foxp3 mRNA的相對表達量低于RA無斑塊組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 3組研究對象IMT、TGF-β1和Foxp3水平的比較

與正常對照組比較，*P<0.05；與RA無斑塊組比較，#P<0.05

3.回歸模型分析：以IMT為應(yīng)變量(Y)，病程、TC、TG、HDL、LDL、DAS28、TGF-β1和Foxp3為自變量(x)進行回歸分析，篩選出動脈粥樣硬化的影響因素。結(jié)果顯示回歸方程差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TC、LDL、Foxp3和TGF-β1為動脈粥樣硬化的危險因素(P<0.05)，HDL為動脈粥樣硬化的保護因素(P<0.05，表3)。

表3 動脈粥樣硬化影響因素的回歸分析(n=96)

討 論

RA是一種由自身免疫性T細胞對自身抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答而引起的自身免疫性疾病，T 細胞及其亞群的功能紊亂和分泌細胞因子異常在RA的啟動過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。CD4+CD25+Treg(regulatory T cell，Treg)細胞是一種具有免疫抑制功能的T細胞亞群，可以抑制T細胞的活性和功能，維持機體的免疫耐受[9]。研究表明，Treg細胞可以通過抑制性細胞因子依賴機制和細胞接觸性依賴機制抑制自身免疫 T 細胞的活化，顯著抑制其他T細胞亞群的增殖[10]。Foxp3是Treg細胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在Treg細胞細胞特異性表達是Treg細胞發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素，在免疫抑制和免疫耐受中發(fā)揮決定性地位[11]。Foxp3基因突變與免疫失調(diào)性基因疾病、X-相關(guān)綜合征、多發(fā)性內(nèi)分泌腺體病等多種自身免疫性疾病密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3表達降低或功能缺陷可以引起自身免疫性胃炎、特發(fā)性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥等，F(xiàn)oxp3的高表達可以使Treg細胞產(chǎn)生大量免疫抑制因子(如白細胞介素-10)，如白細胞介素-10通過TGF-β依賴性和細胞接觸方式對致病性T細胞發(fā)揮直接作用，產(chǎn)生促炎因子減少[12，13]。

有研究顯示，TGF-β1能調(diào)節(jié)Foxp3的表達[14]。TGF-β1參與胚胎發(fā)育、免疫抑制、組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能，但其生物學(xué)效應(yīng)依賴于Smads蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控，TGF-β1信號從細胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核的過程中依賴于Smads家族蛋白[15]。Smads蛋白共有 3 類：受體活化型Smad(R-Smads)、抑制型Smad(I-Smads)和共同通路型Smad(Co-Smad)，不同Smads蛋白介導(dǎo)不同的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。TGF-β1作為受體復(fù)合物，通過TGF-β1/Samds 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)Smads蛋白進入細胞核內(nèi)，抑制其靶基因(Foxp3)的轉(zhuǎn)錄，使Foxp3 表達下調(diào)[14]。這些研究表明，當(dāng)Foxp3和TGF-β1表達降低時，它們對自身免疫 T 細胞的抑制作用減弱，導(dǎo)致自身免疫性T細胞對自身抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，引起終生免疫性疾病。本研究結(jié)果顯示，在RA組研究對象外周血Foxp3和TGF-β1的表達降低。

RA患者發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險是正常人群的2～3倍，腦卒中的風(fēng)險上升1.7倍[17]。動脈粥樣硬化是心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，其發(fā)生、發(fā)展過程是脂質(zhì)與纖維成分在大動脈沉積，目前認為動脈粥樣硬化是一種慢性炎性疾病。RA的病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)滑膜組織的炎癥，導(dǎo)致如白細胞介素-16、α-腫瘤壞死因子等炎性因子釋放入血。這些炎性因子不僅調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，而且能作用于脂肪組織和血管內(nèi)皮等組織，使機體出現(xiàn)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂和內(nèi)皮功能障礙等，導(dǎo)致促使RA患者動脈粥樣硬化加速進展[18]。近年來研究提示，脂肪因子可能成為RA疾病發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)記，其不僅與健康人群有差異，還與病情和病程密切相關(guān)，而且脂肪因子在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中的作用也得到證實[2]。RA患者在炎性因子的作用下，導(dǎo)致HDL降低，LDH表達增加，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，TC、Foxp3和TGF-β1為炎性動脈粥樣硬化復(fù)發(fā)的獨立危險因素，HDL為炎性動脈粥樣硬化的獨立保護因素，筆者推測，RA患者發(fā)生動脈粥樣硬化的作用過程是Foxp3和TGF-β1表達受到抑制，導(dǎo)致炎性因子釋放增加引起脂肪代謝紊亂，促使動脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中Foxp3、TGF-β1表達明顯受到抑制，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。但由于本研究屬于橫斷面的調(diào)查，結(jié)果的說服力欠佳，后續(xù)將對RA患者進行隨訪，動態(tài)檢測Foxp3、TGF-β1水平，進一步探討Foxp3、TGF-β1與動脈粥樣硬化的關(guān)系，為RA患者合并動脈粥樣硬化的早期診斷和治療提供一個新的思路。