沈 強(qiáng) 許凡凡 司輝清* 潘 科 張小琴 趙振軍

（1貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 貴陽 550006

2西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶北碚 400716

3長江大學(xué)園藝園林學(xué)院 湖北荊州 434023）

GABA（γ-氨基丁酸）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明，GABA除了具有降血壓功能[1]外，還具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)[2]，抗糖尿病[3]，抗疲勞[4]，抗癌[5]，改善腦功能[6]及調(diào)節(jié)激素分泌[7]等功能。目前我國陸續(xù)有GABA綠茶[8]、GABA白茶[9]、GABA紅茶[10]等相關(guān)研究報(bào)道，而鮮見天然發(fā)酵型GABA茶飲料的報(bào)道。目前GABA茶的加工原理主要是先將茶鮮葉進(jìn)行特殊的厭氧處理，使其茶葉中的L-谷氨酸（L-Glu）在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD） 的催化作用下經(jīng) α-位脫羧反應(yīng)生成GABA，然后按照正常的制茶工藝加工為成品茶。在我國，紅茶飲料以傳統(tǒng)發(fā)酵紅茶直接提取后調(diào)配或用紅茶濃縮汁、速溶紅茶粉調(diào)配，存在技術(shù)成本高，工序復(fù)雜，品質(zhì)不穩(wěn)定等問題[11-12]。為解決這些問題，我國從20世紀(jì)80年代開始嘗試研究茶萎凋葉榨汁發(fā)酵技術(shù)。有研究[13-15]嘗試用茶鮮葉液態(tài)發(fā)酵技術(shù)加工發(fā)酵茶飲料，需在發(fā)酵過程中添加一定的輔料，以解決苦澀味重的問題，可以制得品質(zhì)優(yōu)異的發(fā)酵茶飲料。周昀等[16]通過添加作為內(nèi)源酶來源的茶鮮葉，來對低檔綠茶茶湯進(jìn)行懸浮發(fā)酵生產(chǎn)紅茶茶湯，結(jié)果無需添加果膠酶也能達(dá)到較好的發(fā)酵效果，減少了成本。

本研究擬在前期研究[17-19]的基礎(chǔ)上，以夏秋茶茶青為原料，對茶鮮葉富集高含量的GABA，然后將富集處理的茶鮮葉與水混合、粉碎后進(jìn)行固液振蕩發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法確定鮮葉液態(tài)懸浮發(fā)酵GABA紅茶飲料的最佳條件，旨在為研發(fā)一種天然發(fā)酵型GABA茶飲料提供理論依據(jù)，為我國夏秋茶資源提供一種新的開發(fā)利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽2葉至3葉，茶樹品種為福鼎大白，采摘時(shí)間為夏秋季節(jié)。

主要試劑：2，4-二硝基氟苯（99%）、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%），美國sigma公司；四氫呋喃、甲醇等均為色譜醇試劑；正丁醇、乙酸乙酯、無水乙醇、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉等均為分析醇試劑。

主要儀器與設(shè)備：LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；DZ600-2S真空包裝機(jī)，海諾機(jī)械；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；家庭式攪拌機(jī)，美的公司；微波爐，格蘭仕微波爐；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；THZ-C-1臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GABA紅茶飲料制備方法 鮮葉→富集GABA（26℃、0.09 MPa條件下，先厭氧 3 h，再好氧2 h，最后厭氧3 h）→稱量→加純水（茶水比1∶30）→粉碎→振蕩發(fā)酵（搖床）→粗濾（300目）→離心→滅酶殺菌（微波）→GABA紅茶飲料。

1.2.2 液態(tài)懸浮發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn)分析鮮葉粉碎度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度及搖床轉(zhuǎn)速等因素對紅茶液態(tài)懸浮發(fā)酵效果的影響，再結(jié)合茶黃素（TFs）、茶紅素（TRs）、GABA 含量、茶多酚、氨基酸及咖啡堿等內(nèi)含物質(zhì)的綜合影響，確定L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。試驗(yàn)因子水平及編碼見表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Code of factors and levels for the orthogonal

1.2.3 檢測方法 茶黃素、茶紅素的測定方法參照文獻(xiàn)[20]TFs、TRs的測定，茶多酚含量測定參照GB/T 21733-2008，游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314-2002，咖啡堿含量測定參照GB/T 5009.139-2003。

GABA 含量測定[21]：色譜柱：AgilentTC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：A 相為 5 mmol/L醋酸鈉溶液（pH=5.7，含5%四氫呋喃），B相為甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

感官評定方法：采用密碼審評方法，評分標(biāo)準(zhǔn)參見茶飲料品質(zhì)評定方法[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)處理重復(fù)3次，用IBM SPSS Statistic 20.0軟件及Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）及Duncan法多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 粉碎時(shí)間對茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響 在液態(tài)懸浮發(fā)酵過程中控制體系的溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵時(shí)間60 min，設(shè)置不同的粉碎時(shí)間，研究粉碎時(shí)間對茶汁飲料及GABA含量的影響。由結(jié)果（表2）可知在粉碎時(shí)間1～3 min內(nèi)，TFs與茶多酚含量均呈減少趨勢，TFs減少不明顯，而茶多酚減少明顯。這是由于隨著粉碎時(shí)間的增加，鮮葉被破碎加劇，茶多酚反應(yīng)底物與酶充分接觸反應(yīng)，從而使茶多酚含量減少。由于TFs極易向TRs、TBs轉(zhuǎn)化，所以TFs含量逐漸減少，轉(zhuǎn)化生成的TRs、TBs含量增加。TRs與TBs在1～3 min內(nèi)呈上升趨勢，且兩者變化規(guī)律相同，均在3 min時(shí)差異明顯。在混合粉碎1～3 min內(nèi)氨基酸、咖啡堿和GABA變化規(guī)律均不明顯。在兼顧TFs與TRs含量時(shí)選擇粉碎時(shí)間1，2，3 min對液態(tài)發(fā)酵體系做正交分析，以確定最佳粉碎時(shí)間。

表2 粉碎時(shí)間對發(fā)酵紅茶茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響Table2 Effect of crushing time on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.1.2 發(fā)酵溫度對茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響 在液態(tài)懸浮發(fā)酵過程中控制體系的粉碎時(shí)間2 min，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵時(shí)間60 min，設(shè)置不同的發(fā)酵溫度，研究發(fā)酵溫度對茶汁飲料及GABA的影響，結(jié)果見表3。在較低溫度20°C時(shí)，發(fā)酵緩慢，茶多酚被氧化的不多，產(chǎn)生的TFs、TRs及TBs都較低；在25～35℃之間，發(fā)酵開始加劇，茶多酚減少明顯，生成的TFs、TRs含量均較高。這可能是由于溫度對液態(tài)懸浮發(fā)酵中紅茶色素類物質(zhì)的形成與酶活性、溶氧水平及TFs轉(zhuǎn)化[23]有關(guān)。不同發(fā)酵溫度下，茶汁飲料中的氨基酸規(guī)律不明顯，咖啡堿及GABA含量基本無變化，而在25～35℃之間GABA含量總體偏高。綜合考慮制作高GABA發(fā)酵紅茶飲料，TFs、TRs含量高有利于紅茶品質(zhì)的形成，選擇發(fā)酵溫度25，30℃和35℃對液態(tài)發(fā)酵體系做正交分析以確定最佳發(fā)酵溫度。

表3 溫度對發(fā)酵紅茶茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響Table3 Effects of temperature on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響 在液態(tài)懸浮發(fā)酵過程中控制體系的粉碎時(shí)間2 min，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵溫度30℃，設(shè)置不同的發(fā)酵時(shí)間，研究發(fā)酵時(shí)間對茶汁飲料及GABA的影響，結(jié)果見表4。發(fā)酵時(shí)間在15～75 min之間，隨著時(shí)間的增加，茶多酚逐漸被氧化而減少，TFs、TRs與TBs呈上升趨勢。而在90 min時(shí)TFs、TRs含量開始明顯下降，TBs明顯增加。這是由于隨著時(shí)間的延長，TFs向TRs、TBs轉(zhuǎn)化，TRs向TBs轉(zhuǎn)化的緣故。隨著時(shí)間的增加，氨基酸變化規(guī)律不明顯，咖啡堿含量變化不大。GABA含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，在15～45 min內(nèi)變化不明顯，60 min時(shí)變化顯著，隨后雖有增加但變化不明顯，這可能是由于GABA的溶解度在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到飽和的緣故。在45～75 min之間，TFs、TRs含量都較高，GABA含量也較高。在兼顧茶汁飲料的品質(zhì)及GABA含量時(shí)，選擇發(fā)酵時(shí)間45，60，75 min對液態(tài)發(fā)酵體系做正交分析以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響 在液態(tài)懸浮發(fā)酵過程中控制體系的粉碎時(shí)間2 min、發(fā)酵溫度30°C、發(fā)酵時(shí)間 60 min，設(shè)置不同的搖床轉(zhuǎn)速，研究搖床轉(zhuǎn)速對茶汁飲料及GABA的影響，見表5。隨著轉(zhuǎn)速的增加，TFs、TRs變化均不明顯，TRs、TBs均略有增加；茶多酚在較高轉(zhuǎn)速為150 r/min和180 r/min有明顯變化。轉(zhuǎn)速增加可以加大容量傳質(zhì)系數(shù)，增加通氣效率，促進(jìn)茶多酚氧化，然而由于氧氣在水中的溶解度小，供氧量不足，會(huì)影響L-EC的氧化速率并抑制TFs的形成，且促進(jìn)L-EGC的鄰醌生成TRs，從而提高TRs的形成量。供氧仍然是液態(tài)發(fā)酵的重要限制因素。此外，也有可能受發(fā)酵液體積的影響。氨基酸的變化規(guī)律不明顯，咖啡堿含量基本無變化。GABA含量在轉(zhuǎn)速120～180 r/min之間相對較高，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速大有利于GABA含量的溶解。在兼顧茶汁飲料的品質(zhì)及GABA含量時(shí)，選擇搖床轉(zhuǎn)速120，150，180 r/min對液態(tài)發(fā)酵體系做正交分析，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

表4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液態(tài)茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響Table4 Effects of fermentation time on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

表5 搖床轉(zhuǎn)速對茶汁主要內(nèi)含物及GABA含量的影響Table5 Effects of oscillation frequency on main inclusions and GABA content of black tea fermented soup

2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以GABA含量、感官審評分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，分析不同發(fā)酵體系對液態(tài)發(fā)酵茶汁飲料GABA及感官品質(zhì)的影響。

2.2.1 不同發(fā)酵體系對液態(tài)發(fā)酵茶汁飲料中GABA含量的影響 未經(jīng)厭氧處理（室溫空氣下萎凋8 h）的茶鮮葉經(jīng)液態(tài)懸浮發(fā)酵后，其茶汁飲料中的GABA極少，幾乎檢測不到。與對照相比，處理4即茶鮮葉先經(jīng)間隙厭氧處理8 h富集較高的GABA后，再進(jìn)行液態(tài)懸浮發(fā)酵，其茶汁飲料中的GABA含量有較大幅度的提高，可達(dá)24.73 μg/mL，且具有紅茶茶汁的品質(zhì)，而茶汁飲料的TFs、TRs及感官品質(zhì)略低于對照組，這主要與萎凋?qū)t茶品質(zhì)形成的影響有關(guān)，適當(dāng)?shù)奈蛴欣诩t茶品質(zhì)的形成。比較分析表6中的R值可知，RA＞RB＞RD＞RC，4 個(gè)因素對 GABA 含量的影響依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞粉碎時(shí)間＞搖床轉(zhuǎn)速。表7的方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、粉碎時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速對液態(tài)發(fā)酵茶汁飲料中GABA含量的影響不顯著。這說明在液態(tài)發(fā)酵過程中，茶汁飲料中GABA含量變化不明顯，較穩(wěn)定。茶汁飲料中GABA含量的高、低取決于茶鮮葉經(jīng)厭氧處理后GABA的含量。要制作高含量GABA發(fā)酵茶飲料，選擇能富集高含量GABA茶鮮葉的厭氧技術(shù)是關(guān)鍵。

2.2.2 不同發(fā)酵體系對液態(tài)發(fā)酵茶汁飲料感官品質(zhì)的影響 將GABA富集處理后的茶鮮葉與水按照一定比例混合粉碎，經(jīng)一定條件的液態(tài)震蕩發(fā)酵形成的發(fā)酵茶飲料具有正常發(fā)酵紅茶飲料的特點(diǎn)。比較表6中感官評價(jià)的R值可知，RB＞RA＞RD＞RC，這4個(gè)因素對茶汁飲料感官品質(zhì)的影響程度為發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞粉碎時(shí)間＞搖床轉(zhuǎn)速。表7的9個(gè)處理中，感官評價(jià)分?jǐn)?shù)最高的是處理7，即A3B1C3D2，TFs、TRs的含量最高，有利于紅茶茶汁品質(zhì)的形成。表7中感官評價(jià)的方差分析結(jié)果表明，這4個(gè)因素對茶汁飲料的感官品質(zhì)影響顯著。比較感官審評分?jǐn)?shù)T值可知，不同發(fā)酵體系生產(chǎn)發(fā)酵茶汁飲料感官品質(zhì)分?jǐn)?shù)高的較優(yōu)組合是A3B1C3D1，與處理7差別不大。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table6 Results of orthogonal experiment

表7 方差分析表Table7 Analysis of variance

2.2.3 最佳GABA紅茶飲料液態(tài)懸浮發(fā)酵工藝條件 通過采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以GABA含量、感官審評分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，得出最佳的GABA紅茶飲料液態(tài)懸浮發(fā)酵工藝條件：茶鮮葉與純水比1∶30、勻漿粉碎時(shí)間2 min、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵溫度35℃、固液振蕩發(fā)酵時(shí)間45 min，在此條件下GABA含量達(dá) （22.44±1.96）μg/mL，茶黃素（TFs）、茶紅素（TRs）含量分別為（0.58 ±0.05）%，（5.52±0.04）%。

為了驗(yàn)證最佳工藝條件，在最佳發(fā)酵工藝條件下做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)平均結(jié)果為GABA含量達(dá)22.48 μg/mL，茶黃素 （TFs）、 茶紅素（TRs）含量分別為0.59%，5.54%，與預(yù)測值較為接近，說明正交分析法得出的GABA紅茶飲料液態(tài)懸浮發(fā)酵工藝條件可靠。

3 結(jié)論

TFs、TRs與紅茶感官品質(zhì)密切相關(guān)，TFs是紅茶汁色“亮”的主要成分，TFs含量高，茶汁金黃明亮，而TFs含量低，茶汁深暗。TRs是構(gòu)成紅茶汁色“紅”的主要物質(zhì)，其刺激性不如TFs，收斂性較強(qiáng)，滋味甜醇。一般TFs、TRs含量均較高，TBs含量低，紅茶品質(zhì)優(yōu)良。此外，GABA含量對茶汁飲料品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定影響，曾貞等[24]發(fā)現(xiàn)制成的GABA綠茶與常規(guī)綠茶相比差別很大，GABA綠茶的湯色、葉底與烏龍茶相似，特征香氣類似熟紅棗香，并帶有酸悶氣味。比較表6中GABA與感官評價(jià)的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，GABA含量高的茶汁飲料的感官評價(jià)的分?jǐn)?shù)低，這可能是由于GABA帶有苦味，且厭氧處理造成茶葉常帶有酸悶氣味，從而影響茶葉的品質(zhì)。GABA含量高是否會(huì)對茶汁飲料的品質(zhì)帶來不利的影響，有待研究。不同發(fā)酵體系對GABA含量影響不顯著，粉碎2 min的發(fā)酵液中GABA含量略高于粉碎1 min的。在兼顧GABA高含量及感官評價(jià)的同時(shí)，篩選到GABA茶鮮葉液態(tài)發(fā)酵體系的最優(yōu)組合是A3B1C3D2，即將富集GABA的茶鮮葉與純水按茶水比1∶30混合粉碎2 min后，在搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度35°C，固液振蕩發(fā)酵45 min時(shí)效果最佳，GABA含量達(dá)22.44 μg/mL，茶黃素 （TFs）、 茶紅素（TRs）含量較高。

總之，厭氧處理后的茶鮮葉經(jīng)液態(tài)懸浮發(fā)酵，其茶汁飲料達(dá)到發(fā)酵紅茶飲料應(yīng)有的品質(zhì)，然而關(guān)于人體攝入GABA的健康標(biāo)準(zhǔn)及有益范圍尚未明確，茶汁飲料中的GABA含量是否越高越有益還有待探究。此外，由于TFs、TRs受供氧量、pH值等因素的影響，茶汁飲料的感官品質(zhì)與常規(guī)紅茶茶汁飲料的品質(zhì)相比差距較大。后期將以如何同時(shí)保證GABA高含量和提高發(fā)酵茶汁飲料的品質(zhì)作為研究的重點(diǎn)。