羅 磊 張冰潔 韋倩倩 樊金玲 馬麗蘋 關(guān)寧寧 朱文學(xué)

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心 河南洛陽 471023）

機體在生理代謝過程中會產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或清除過慢時，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，自由基作用于大分子物質(zhì)，生成大量有害物質(zhì)，影響細胞正常生理功能[1]。此外，研究表明，自由基與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、炎癥、癌癥、衰老等[2-4]。植物黃酮廣泛分布于自然界，具有抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗炎免疫及抗衰老等功效，被認為是具有巨大開發(fā)前景的天然抗氧化劑[5]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為食藥兼用植物，具有清熱解毒，保肝利膽，抗菌消炎等功效[6-7]，近幾年報道金銀花提取液具有清除自由基及抗氧化的作用[8]。目前，金銀花中的黃酮類化合物已成為研究熱點，國內(nèi)外學(xué)者在金銀花黃酮的抗氧化及抗炎功效方面進行了大量的研究。劉昌平[9]通過豬油體系和亞油酸體系進行檢測，表明金銀花黃酮具有顯著的抗氧化活性。沈玲玲等[10]研究證明金銀花黃酮對·OH自由基具有明顯的清除作用，清除率高達92.22%。Ok-Hwa等[11]也證實金銀花中的木犀草素能夠抑制促炎細胞介質(zhì)的釋放，從而起到抗炎作用。劉豪等[12]研究表明，金銀花黃酮乙醇提取物清除·OH和DPPH·能力較強，其清除自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚的含量具有一定的相關(guān)性。目前大部分研究報道集中于對金銀花黃酮體外清除自由基方面的評價，而金銀花黃酮對細胞及機體影響的研究較少。本研究通過過氧化氫誘導(dǎo)RAW264.7細胞損傷，建立細胞氧化損傷模型，測定細胞及細胞培養(yǎng)液中TAOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT 水平，探討金銀花黃酮對過氧化氫誘導(dǎo)的細胞損傷的保護機制，為揭示金銀花黃酮的抗氧化作用機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花黃酮由本實驗室工作人員以金銀花為原料，采用超聲輔助乙醇提取，經(jīng)D101大孔吸附樹脂純化所得。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素），美國Gibco公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），美國 Sigma 公司；T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT 測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

CKX41倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；680全自動酶標儀，美國Bio-Rad公司；UV2400紫外-可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；E191IR型CO2細胞培養(yǎng)箱，美國金西盟公司；微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HL-2D型恒流泵，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花黃酮的提取 準確稱取過80目篩的金銀花粉末50 g，用體積分數(shù)60%的乙醇按料液比 1∶50（g/mL）的比例混合均勻，于超聲功率200 W，提取溫度50℃的條件下超聲提取35 min，抽濾，50℃下減壓濃縮至無醇味，真空冷凍干燥成粉，備用。

1.3.2 金銀花黃酮的純化 預(yù)處理D101樹脂，將1.3.1節(jié)中所得金銀花葉黃酮配成3.0 mg/mL的上樣液，調(diào)節(jié)其pH值至2.46，以1.50 mL/min的流速上樹脂柱純化，先用2.0 BV蒸餾水以1.50 mL/min的流速洗脫以除雜，再用體積分數(shù)為95%的乙醇溶液（pH11.0）以3.0 mL/min的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋蒸，凍干后于4℃保存，備用。

1.3.3 RAW264.7細胞培養(yǎng)[13]將RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%時傳代，取對數(shù)生長期細胞做后續(xù)試驗。

1.3.4 過氧化氫誘導(dǎo)RAW264.7細胞氧化損傷模型的建立 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于96孔板中，每孔200 L，細胞密度2.0×105個/mL。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h至細胞貼壁，棄上清，加入用RPMI-1640培養(yǎng)基配制的不同濃度的H2O2溶液，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上清，用PBS洗滌2次，每孔分別加入200 L培養(yǎng)基及10 L質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，放入培養(yǎng)箱4 h后停止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 L DMSO，輕微振蕩10 min使紫色結(jié)晶溶解，放入酶標儀中于波長490 nm處測定吸光度。計算細胞存活率。

式中：A0——空白組的平均吸光度；A1——特定濃度樣品液組的平均吸光度。

1.3.5 金銀花黃酮劑量的篩選 細胞培養(yǎng)過程同1.3.4節(jié)，僅將加入的RPMI-1640培養(yǎng)基配制的H2O2溶液換成同種培養(yǎng)基配制的不同濃度的金銀花黃酮溶液，并計算細胞存活率。

1.3.6 細胞及細胞培養(yǎng)液中T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH及CAT水平的測定 將細胞密度為2.0×105個/mL的RAW264.7細胞接種于6孔板中，每孔 2.0 mL，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁，吸棄上清液。在空白組和模型組加入2.0 mL培養(yǎng)基；在試驗組分別加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度的金銀花黃酮培養(yǎng)液；在對照組加入2.0 mL 250 g/mL VC培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄上清液，每孔加入750 mol/L H2O2溶液2.0 mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后將細胞和細胞培養(yǎng)液分離。將細胞培養(yǎng)液離心（4℃，1 500 r/min，5 min）后取上清液待測；細胞用PBS清洗 2 次后離心（4 ℃，1 000 r/min，10 min），保留細胞團塊，加入0.5 mL PBS，冰水浴條件下超聲破碎（300 W，3～5 s/次，間隔 30 s，重復(fù) 3 次），待測。參照相應(yīng)試劑盒方法測定細胞及細胞培養(yǎng)液中T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS 7.5軟件進行統(tǒng)計分析，測定數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析并用LSD法進行多重比較，不同小寫字母表示組間比較差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫濃度

由圖1可知，不同濃度的過氧化氫對RAW264.7細胞的生長均有一定抑制作用，且細胞存活率隨過氧化氫濃度的升高而降低。與空白組相比，不同濃度的H2O2均顯著抑制RAW264.7細胞的存活（P＜0.05），用750 mol/L過氧化氫處理時，RAW264.7細胞的存活率達到51.57%。過氧化氫濃度太低時對細胞造成的損傷不明顯，而過氧化氫濃度過高會造成細胞死亡過量。建模時選取過氧化氫濃度為750 mol/L。

圖1 不同濃度H2O2對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on proliferation of RAW264.7 cells

2.2 金銀花黃酮濃度的篩選

由圖2可知，與空白組相比，質(zhì)量濃度在0～250 mg/mL范圍的金銀花黃酮均可以促進RAW264.7細胞的增殖。當(dāng)金銀花黃酮質(zhì)量濃度小于62.5 mg/mL時，促增殖作用不顯著（P＞0.05）；當(dāng)其質(zhì)量濃度為62.5，125，250 mg/mL時，促增殖作用顯著（P＜0.05）；當(dāng)金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度大于250 mg/mL時顯著抑制細胞增殖（P＜0.05）。選擇金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度62.5，125，250 mg/mL作為推薦劑量進行后續(xù)試驗。

圖2 不同濃度金銀花黃酮對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of honeysuckle flavonoids on proliferation of RAW264.7 cells

2.3 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中T-AOC活性

機體防御體系中總抗氧化能力（T-AOC）的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動態(tài)平衡，清除過多的活性氧，使機體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)[14]。如圖3所示，與空白組相比，模型組細胞及細胞培養(yǎng)液中T-AOC活性均顯著降低（P＜0.05）。添加金銀花黃酮可以提高細胞及細胞培養(yǎng)液中T-AOC活性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細胞培養(yǎng)液中的T-AOC活性接近VC對照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細胞及細胞培養(yǎng)液中的T-AOC活性均低于VC對照組，差異顯著（P＜0.05）。

圖3 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中T-AOC活性Fig.3 T-AOC activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.4 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中SOD活性

SOD幾乎存在于所有生物細胞中，能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，是一種重要的抗氧化劑[15]。如圖4所示，與空白組相比，模型組細胞和細胞培養(yǎng)液中的SOD活性均顯著下降（P＜0.05），而添加金銀花黃酮能有效升高細胞及細胞培養(yǎng)液中SOD活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細胞中的SOD活性接近VC對照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細胞及細胞培養(yǎng)液中的GSH含量均低于VC對照組，差異顯著（P＜0.05）。

2.5 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中MDA含量

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量的高、低間接反映膜系統(tǒng)受損程度[16]。如圖5所示，與空白組相比，模型組細胞和細胞培養(yǎng)液中的MDA含量均顯著上升（P＜0.05）。金銀花黃酮低、中、高劑量組均顯著抑制由H2O2引起的細胞和細胞培養(yǎng)液中MDA含量的增加，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。VC對照組的MDA含量低于金銀花黃酮各劑量組，且有顯著差異（P＜0.05）。

圖4 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中SOD活性Fig.4 SOD activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

圖5 RAW264.7細胞（A）及細胞培養(yǎng)液（B）中MDA含量Fig.5 MDA content in RAW264.7 cells （A） and cell culture medium （B）

2.6 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中GSH含量

GSH可以幫助機體保持正常的免疫功能，且具有抗氧化和整合解毒功效，在機體解毒代謝過程中具有重要作用[17]。如圖6所示，與空白組相比，模型組細胞和細胞培養(yǎng)液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），而金銀花黃酮低、中、高劑量組抑制了細胞及細胞培養(yǎng)液中GSH含量的下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細胞液中的GSH含量接近VC對照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細胞及細胞培養(yǎng)液中的GSH含量均低于VC對照組，差異顯著（P＜0.05）。VC對照組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中GSH含量Fig.6 GSH content in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.7 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性

GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，它可以保護機體免受脂質(zhì)過氧化物的損傷[18]。如圖7所示，與空白組相比，模型組細胞和細胞培養(yǎng)液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），金銀花黃酮各劑量組顯著抑制了細胞及細胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的降低（P＜0.05）。對于細胞，金銀花黃酮低、中、高劑量組之間存在明顯的劑量依懶性（P＜0.05）。VC對照組在細胞及細胞培養(yǎng)液中的GSH-Px活性顯著高于金銀花黃酮各劑量組，且具有顯著差異（P＜0.05）。

圖7 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中GSH-Px活性Fig.7 GSH-Px activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.8 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中LDH活性

LDH存在于細胞內(nèi)，能催化丙酮酸生成乳酸，當(dāng)細胞受損時LDH將大量釋放，導(dǎo)致細胞外LDH水平的顯著升高，因此LDH活性可以反映細胞受氧化損傷程度[19]。如圖8所示，與空白組相比，模型組細胞中的LDH活性顯著降低（P＜0.05），而細胞培養(yǎng)液中的LDH活性顯著升高（P＜0.05），表明H2O2使細胞膜受損導(dǎo)致LDH外漏。與模型組相比，金銀花黃酮各劑量組顯著升高了細胞中LDH活性，降低了細胞培養(yǎng)液中LDH活性（P＜0.05），并呈劑量依賴性，表明金銀花黃酮可以預(yù)防或減緩細胞膜受損程度，阻止細胞內(nèi)LDH外漏。金銀花黃酮中、高劑量組在細胞中的LDH活性接近VC 對照組，無顯著差異（P＞0.05）；金銀花黃酮高劑量組在細胞培養(yǎng)液中的LDH活性顯著高于VC對照組（P＜0.05）。

2.9 RAW264.7細胞及細胞培養(yǎng)液中CAT活性

CAT普遍存在于生物機體內(nèi)，它可以催化H2O2分解為H2O與O2，保護機體免受有害物質(zhì)損傷[20]。如圖9所示，與空白組相比，模型組細胞和細胞培養(yǎng)液中的CAT活性明顯降低 （P＜0.05），金銀花黃酮各劑量組顯著提高了細胞及細胞培養(yǎng)液中CAT活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。金銀花黃酮高劑量組在細胞及細胞液中的CAT活性均接近 VC 對照組（P＞0.05）。

圖8 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中LDH活性Fig.8 LDH activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

圖9 RAW264.7細胞（a）及細胞培養(yǎng)液（b）中CAT活性Fig.9 CAT activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

3 討論與結(jié)論

本研究通過過氧化氫處理RAW264.7細胞來制備氧化應(yīng)激損傷模型，探討金銀花黃酮對細胞氧化損傷的保護作用。研究結(jié)果表明，經(jīng)750 mol/L過氧化氫處理的RAW264.7細胞存活率顯著下降，在質(zhì)量濃度0～250 mg/mL范圍的金銀花黃酮均可以促進RAW264.7細胞的增殖，其中質(zhì)量濃度在62.5～250 mg/mL范圍時，促增殖作用顯著。

通過測定細胞和細胞培養(yǎng)液中總抗氧化能力（T-AOC）、 超氧化物歧化 酶 （SOD）、 丙 二醛（MDA）、谷胱苷肽（GSH）、谷胱苷肽過氧化物酶（GSH-Px）、 乳酸脫氫酶 （LDH） 及過氧化氫酶（CAT）的水平來反映金銀花黃酮對過氧化氫誘導(dǎo)損傷的RAW264.7細胞的保護程度。研究發(fā)現(xiàn)處理RAW264.7細胞后，細胞與細胞培養(yǎng)液中MDA含量顯著升高，T-AOC 水平、SOD、GSH-Px、CAT活性及GSH含量均顯著降低；細胞中LDH活性下降，細胞培養(yǎng)液中LDH活性升高，這表明過氧化氫對RAW264.7巨噬細胞具有明顯的毒性作用，會使細胞膜結(jié)構(gòu)受損，細胞內(nèi)各種酶活性下降。而不同劑量金銀花黃酮修復(fù)損傷細胞時，上述指標較模型組均獲得不同程度的改善。金銀花黃酮一方面通過提高細胞和細胞培養(yǎng)液中GSH含量及SOD、GSH-Px、CAT活性，清除有毒有害物質(zhì)和自由基，緩解細胞所受到的損傷；另一方面通過減少MDA含量來降低脂質(zhì)過氧化物含量，減緩細胞膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強機體抵抗自由基攻擊的能力[21]，保持生物膜的結(jié)構(gòu)完整和膜表面蛋白質(zhì)的功能，減輕LDH向細胞外擴散的程度。

綜上所述，金銀花黃酮可以顯著緩解過氧化氫損傷導(dǎo)致的RAW264.7巨噬細胞活力下降，其保護作用可能與增強細胞內(nèi)抗氧化酶活性，清除氧自由基及有害物質(zhì)，維持細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性有關(guān)。