孫 靜，袁俊清，楊夢(mèng)迪，王智煜，姚光宇，周亦一，趙 暉

1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233；

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院病理科，上海 200233

在病理學(xué)活檢技術(shù)中，對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣處理是一大技術(shù)難點(diǎn)。然而骨組織的病理學(xué)診斷結(jié)果是惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者確定治療方案的重要依據(jù)，因此制備質(zhì)量良好的骨組織免疫組織化學(xué)切片尤為重要。傳統(tǒng)的骨組織脫鈣采用強(qiáng)酸溶液脫鈣，雖然脫鈣速度快，但對(duì)組織細(xì)胞的核物質(zhì)及蛋白質(zhì)破壞明顯，從而影響病理學(xué)診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脫鈣法取得了一定進(jìn)展，EDTA是一種脫鈣螯合劑，對(duì)組織破壞小，且能保存組織中的核物質(zhì)和抗原物質(zhì)的活性。但EDTA脫鈣法也有其不足之處，EDTA脫鈣液作用緩慢，一般需要4～6周，延長(zhǎng)了病理學(xué)活檢的周期。而改良的EDTA脫鈣法進(jìn)一步縮短了作用時(shí)間，將處理周期縮短為2周。

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1］，每年全球約有139萬(wàn)新發(fā)病例，46萬(wàn)死亡病例[2］，中國(guó)乳腺癌的新發(fā)和死亡病例數(shù)分別占12.2%和9.6%[3］。晚期乳腺癌常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率大于70%，高于肺、腦等其他部位。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生存期約為2年，且常出現(xiàn)嚴(yán)重骨痛、病理性骨折、脊髓神經(jīng)壓迫、高鈣血癥等骨相關(guān)事件（skeletal-related event，SRE），患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重降低[4］，最終導(dǎo)致患者死亡。對(duì)骨轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行病理學(xué)活檢，明確診斷，對(duì)指導(dǎo)治療、改善預(yù)后具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)比較改良EDTA脫鈣法與酸脫鈣法在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移免疫組織化學(xué)檢測(cè)中使用效果的差異。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院2012年1月—2018年1月確診為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病例116例，收集患者的基本信息，如原發(fā)年齡、骨轉(zhuǎn)移的性質(zhì)、數(shù)量、是否發(fā)生SRE等。根據(jù)患者骨穿刺組織樣本的處理方法分為兩組：41例為改良EDTA脫鈣組，75例為酸脫鈣組。

1.2 試劑器材及樣本

光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，EDTA購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸、甲酸、乙酸、4%甲醛溶液、乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。骨穿刺組織樣本均取自上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院患者。

1.3 脫鈣液的配制

EDTA脫鈣液配制：① 蒸餾水2 000 mL，等分為3份；② 1/3蒸餾水+PBS，充分溶解為A溶液；③ 2/3蒸餾水+NaOH，充分溶解為B溶液；④ EDTA+B液，充分混合為C液；⑤ A液+C液，充分混合為D液；⑥ D液加入HCl，pH值調(diào)至7.2～7.4（NaOH為85 g；EDTA為100 g；HCl為85 mL）。

酸脫鈣液配制：① 4%甲醛溶液66.5%；② 鹽酸5.0%；③ 甲酸10.0%；④ 乙酸2.5%；⑤95%乙醇溶液16.0%。

1.4 脫鈣及切片

改良EDTA脫鈣組：骨穿刺標(biāo)本用4%中性甲醛溶液固定24 h，流水沖洗0.5～1.0 h，然后將標(biāo)本放入20倍體積的10%EDTA脫鈣液中，37 ℃搖床上振蕩，每天更換EDTA脫鈣液，3～5 d后采用自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片數(shù)張，厚4 μm，65 ℃烤片3 h。

酸脫鈣組：穿刺標(biāo)本用4%甲醛溶液固定、將骨組織的穿刺標(biāo)本在酸脫鈣液內(nèi)浸泡脫鈣、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片數(shù)張，厚4 μm，65 ℃烤片3 h。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

EDTA脫鈣組：常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；抗原修復(fù)pH=9.0 EDTA，煮沸20 min；若無(wú)抗原修復(fù)則直接水洗進(jìn)入下一步；自然冷卻后，充分水洗，用PBS洗3次，每次2 min；滴加一抗，37 ℃溫育1 h；用PBS洗3次，每次2 min；滴加二抗，37 ℃溫育0.5 h；用PBS洗3次，每次2 min；DAB顯色5 min，水洗；蘇木精復(fù)染2 min，水洗，藍(lán)化數(shù)秒，水洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片；顯微鏡下觀察。

酸脫鈣組：常規(guī)二甲苯脫蠟，水化；溫育一抗、二抗，顯色；藍(lán)化，藍(lán)化完成后，放入0.5%伊紅乙醇溶液復(fù)染2 min；逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片；顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用IBM SPSS statistics 24.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s 表示，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier繪制生存曲線，結(jié)果均為雙尾，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況和臨床特征

2012年1月—2018年1月，收集病理學(xué)診斷為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者116例，其中91.4%為溶骨性骨轉(zhuǎn)移，80.1%骨轉(zhuǎn)移的數(shù)量為4～20個(gè)，43.1%發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，81.9%發(fā)生SRE，78.4%原發(fā)乳腺癌為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性，69.8%為孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽(yáng)性。

2.2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨穿刺樣本脫鈣處理結(jié)果

41例為改良EDTA脫鈣，75例為酸脫鈣，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)改良EDTA脫鈣組和酸脫鈣組骨組織的結(jié)構(gòu)和抗原物質(zhì)均完整，但改良EDTA脫鈣組骨組織損傷小于酸脫鈣組，且染色效果好（圖1）。

圖 1 骨穿刺樣本染色結(jié)果Fig. 1 Staining results of bone biopsy samples

兩組患者的發(fā)病年齡、骨轉(zhuǎn)移年齡、原發(fā)病灶的性質(zhì)、SRE、是否內(nèi)臟轉(zhuǎn)移等基本情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；改良EDTA脫鈣組原發(fā)乳腺癌ER的陽(yáng)性率為82.9%，酸脫鈣組為76.0%（P=0.39）；改良EDTA脫鈣組原發(fā)乳腺癌PR陽(yáng)性率（87.8%）高于酸脫鈣組（60.0%）（P＜0.05，表1）。

改良EDTA脫鈣組原發(fā)乳腺癌與骨轉(zhuǎn)移組織免疫組織化學(xué)結(jié)果ER一致性為95.1%，明顯高于酸脫鈣組（69.3%）（P＜0.05，表2）；改良EDTA脫鈣組中37（90.2%）例ER+，24（58.5%）例PR+，38（92.7%）例Ki-67+；酸脫鈣組中，55（73.3%）例ER+，27（36.0%）例PR+，25（33.3%）例Ki-67+。改良EDTA脫鈣組中ER、PR、Ki-67的陽(yáng)性率分別高于酸脫鈣組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移骨組織切片的染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 生存分析

ER+患者的平均生存時(shí)間為（41.09±4.26）個(gè)月，明顯優(yōu)于E R-[2 5.8 1±5.7 1 個(gè)月］（ P ＜0 . 0 5 ） ； P R+患 者 的 平 均 生 存 時(shí)間為（4 2.3 6±5.2 7）個(gè)月優(yōu)于P R-患者[（32.92±4.25）個(gè)月］（P=0.076，圖3）。

表 1 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者一般資料Tab. 1 General information of BC patients with bone metastasis[n (%)］

表 2 EDTA脫鈣組和酸脫鈣組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者原發(fā)與轉(zhuǎn)移骨組織內(nèi)分泌受體一致性情況Tab. 2 Consistency of endocrine receptors in primary and metastatic bone tissues of patients in two groups[n (%)］

表 3 改良EDTA脫鈣組、酸脫鈣組骨轉(zhuǎn)移組織ER、PR和Ki-67情況Tab. 3 Endocrine receptor status and Ki-67 of bone metastasis tissues in two groups[n (%)］

圖 2 轉(zhuǎn)移骨組織病理切片染色結(jié)果Fig. 2 Results of pathological staining of metastatic bone tissues

圖 3 患者生存曲線Fig. 3 Patient's survival curve

3 討 論

骨組織脫鈣是病理學(xué)活檢的一大難題，而且各種惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，其中乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達(dá)70%[5］，所以采用合適的骨組織脫鈣方法進(jìn)行病理學(xué)檢查對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

本研究收集2012年1月—2018年1月病理學(xué)診斷為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者臨床資料，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者多為多發(fā)溶骨性骨轉(zhuǎn)移，常合并內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，且SRE的發(fā)生率高。所以免疫組織化學(xué)檢查骨轉(zhuǎn)移組織ER、PR的狀態(tài)對(duì)指導(dǎo)患者治療、改善預(yù)后具有重要意義。本文以骨組織為研究對(duì)象，分析用改良EDTA脫鈣法及傳統(tǒng)的酸脫鈣法進(jìn)行脫鈣處理，檢測(cè)兩組骨組織的損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良EDTA脫鈣法和酸脫鈣法都能較完整地保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，但是改良EDTA脫鈣組的骨組織染色效果優(yōu)于酸脫鈣組。EDTA脫鈣法能夠更好地保持骨組織中的抗原物質(zhì)，但是標(biāo)本處理需要2周時(shí)間，不利于快速診斷。吳拮等[6］認(rèn)為EDTA脫鈣液的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)骨組織損傷小且H-E染色效果好，但用時(shí)較長(zhǎng)。劉大維等[7］發(fā)現(xiàn)改良EDTA骨組織脫鈣法對(duì)骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)保存較好。同樣，趙雨坤等[8］通過(guò)對(duì)小鼠骨組織的研究發(fā)現(xiàn)他們改良后的EDTA脫鈣法，在溫度4 ℃和脫鈣液更換周期24 h的條件下，脫鈣速度較快（7 d），且對(duì)骨組織結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。Keithley等[9］認(rèn)為微波結(jié)合EDTA脫鈣可以較好地保存顳骨中抗原的結(jié)構(gòu)。這些研究均表明EDTA脫鈣法對(duì)骨組織的保護(hù)性更好。

本實(shí)驗(yàn)將改良EDTA脫鈣法應(yīng)用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者，發(fā)現(xiàn)改良EDTA脫鈣組原發(fā)乳腺癌與骨轉(zhuǎn)移組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果ER的一致性明顯高于酸脫鈣組，且ER、PR陽(yáng)性患者的生存期高于陰性患者，所以準(zhǔn)確地判斷ER、PR的情況是非常重要的。乳腺癌轉(zhuǎn)移骨組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果能夠指導(dǎo)臨床治療，如采取內(nèi)分泌治療等[10-11］，有利于改善患者的預(yù)后。結(jié)果顯示，改良EDTA脫鈣組的免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果更準(zhǔn)確，是指導(dǎo)患者臨床治療的更可靠依據(jù)。吳鴻雁等[12］通過(guò)硝酸、EDTA和RapidCal三種不同脫鈣液對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移樣本進(jìn)行脫鈣的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸處理后標(biāo)本的染色效果最差，EDTA脫鈣液處理的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織樣本在形態(tài)、免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）的應(yīng)用上表現(xiàn)出優(yōu)秀的標(biāo)本質(zhì)量，與本研究結(jié)果相一致。Liu等[13］發(fā)現(xiàn)，10%的中性EDTA脫鈣液對(duì)大鼠股骨形態(tài)和抗原性保存較好，是用于免疫組織化學(xué)染色的優(yōu)選脫鈣劑。Savi等[14］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中10%EDTA脫鈣液處理的組織免疫組織化學(xué)檢查效果最佳。Schrijver等[15］指出EDTA是骨組織脫鈣首選，因?yàn)樗幚砗鬅晒庠浑s交和DNA/RNA分離效果最好。翁丹楓等[16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，改良EDTA脫鈣液處理的骨髓H-E切片質(zhì)量佳，免疫組織化學(xué)染色效果好、定位準(zhǔn)確，且具有脫鈣時(shí)間較短等優(yōu)勢(shì)，是骨髓組織活檢較為理想的脫鈣液。我們的研究表明EDTA在骨組織脫鈣中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

本研究根據(jù)改良EDTA脫鈣和酸脫鈣的不同處理方法，對(duì)2012年1月—2018年1月的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行分組，對(duì)兩組免疫組織化學(xué)結(jié)果中的內(nèi)分泌受體陽(yáng)性率進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)改良EDTA脫鈣法處理的標(biāo)本在形態(tài)學(xué)和常用免疫組織化學(xué)的應(yīng)用上效果較好，能夠保證免疫組織化學(xué)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于骨組織的病理學(xué)檢查，與傳統(tǒng)的EDTA脫鈣方法相比能在一定程度上縮短脫鈣的時(shí)間。本研究表明，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移多為多發(fā)溶骨性骨轉(zhuǎn)移，且SRE發(fā)生率高；改良EDTA脫鈣法對(duì)骨組織的保護(hù)作用優(yōu)于強(qiáng)酸脫鈣，提高了病理學(xué)活檢及免疫組織化學(xué)檢查的準(zhǔn)確性，對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者的病理學(xué)診斷及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。