吳曉利，張志明，何冬旭

（江南大學1.生物工程學院，2.國家功能食品工程技術研究中心，江蘇無錫214122）

鎘（cadmium，Cd）是中國土壤的主要重金屬污染物之一。Cd 在人體內的半衰期長達30～40 年，是最易在人體內積聚的有毒重金屬之一，具有致畸性和致癌性[1-4]，國際癌癥研究機構已確認Cd 及其化合物為Ⅰ類致癌物。

環(huán)境污染和職業(yè)接觸均可造成Cd 中毒，Cd 及含Cd 化合物主要從呼吸系統和消化系統進入體內[5-6]。其中，Cd污染食品的攝入是人體Cd暴露的主要途徑。食物中的Cd 在攝入后，首先經胃腸道吸收進入血液循環(huán)，之后在肝、腎、骨骼及其他組織中蓄積[7-8]，該過程伴隨著消化道、肝、腎等組織的損傷，臨床典型癥狀主要表現為腸胃炎、肝功能異常、腎炎和骨質疏松等。由于肝、腎損傷是Cd 中毒中最為典型的癥狀，目前國內外對其損傷的評價方法和機制研究有較多報道[9-10]。相比而言，針對胃腸道Cd損傷的研究較少，損傷機制尚不明確。因此，本研究利用小鼠Cd中毒模型探討Cd對十二指腸的損傷作用及其機制，進一步闡明Cd的毒性作用，并為Cd中毒患者的腸道損傷護理提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

CdCl2（CdCl2·5/2 H2O）購自上海麥克林生化科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、細胞核熒光染料DAPI 均購自上海碧云天生物技術有限公司；胰島素購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；表皮細胞生長因子購自美國派普泰克公司；膠原酶XI購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；DMEM 培養(yǎng)基和Cd/鉛綠色熒光探針Leadmium Green AM購自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；兔抗小鼠活化的胱天蛋白酶3多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；小鼠抗小鼠E-鈣黏蛋白單克隆抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司；小鼠抗小鼠β肌動蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體、Alexa Fluor?488 驢抗小鼠IgG（H+L）抗體購自美國英杰生命技術有限公司；CellTiter-Blue?細胞活力試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司。

Synergy H4 全功能微孔板檢測儀購自美國伯騰儀器有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡購自德國萊卡公司；C6流式細胞儀購自美國碧迪公司。

1.2 動物和分組

6 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質量20～25 g，購自南京大學模式動物研究所，動物合格證號：SYXK（蘇）2016-0012。小鼠飼養(yǎng)在江南大學醫(yī)學院動物中心，光照12 h，環(huán)境濕度50%，溫度22～25℃，自由進食飲水。

小鼠隨機分成染毒組和正常對照組，參照文獻[11-12]的Cd中毒劑量和方法，連續(xù)30 d每天1次ig給予小鼠CdCl210 mg·kg-1或生理鹽水，建立慢性Cd中毒小鼠模型；參照文獻[11，13-14]的Cd中毒劑量和方法，單次ig給予CdCl280 mg·kg-1或生理鹽水，建立急性Cd中毒小鼠模型，并持續(xù)觀察小鼠生存狀況和生存率。

1.3 十二指腸上皮細胞的制備與培養(yǎng)

參照文獻[15-17]，小鼠脫頸處死，取十二指腸2～3 cm，轉移至PBS中，移液管多次沖洗腸內容物。剪切組織至約2 mm大小，加入膠原酶Ⅺ0.3 g·L-1，37℃水浴震蕩消化3 次，每次5 min，靜置，棄上清液；再加入膠原酶Ⅺ0.3 g·L-1，37 ℃水浴震蕩消化3 次，每次10 min，靜置，上清液均收集至新的離心管中，100×g離心3 min，將細胞重懸于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、表皮生長因子1 g·L-1和胰島素0.25 kU·L-1的DMEM）中，于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄未貼壁的細胞，PBS 清洗2 次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d 后用于實驗。

1.4 十二指腸上皮細胞的鑒定

將1.3分離培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞以每皿4×104細胞接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗小皿3次，封閉1 h，加小鼠抗小鼠E-鈣黏蛋白一抗（1∶250）4℃孵育過夜。之后，PBS 清洗并加入Alexa Fluor?488 驢抗小鼠熒光二抗（1∶200），室溫孵育2 h。再加入細胞核熒光染料DAPI（1∶1000）孵育10 min。最后，避光條件下進行激光共聚焦顯微鏡拍照。Alexa Fluor?488 驢抗小鼠熒光二抗的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為488 和519 nm；DAPI的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為364 和454 nm。

1.5 激光共聚焦檢測Cd暴露小鼠十二指腸上皮細胞內Cd離子含量

小鼠急、慢性Cd 中毒后24 h，將小鼠處死，按1.3 和1.4 制備和鑒定十二指腸上皮細胞。將細胞以每皿4×104接種于共聚焦小皿中，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，0.85%氯化鈉溶液清洗3 次，加入5 mg·L-1Leadmium Green AM[18]，37℃避光孵育30 min，0.85%氯化鈉溶液清洗3次，加入0.85%氯化鈉溶液500 μL，使用激光共聚焦顯微鏡于激發(fā)光波長490 nm 和發(fā)射光波長520 nm 檢測熒光強度，表示細胞內Cd離子含量。

1.6 CellTiter-Blue?檢測體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞的細胞活力

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細胞。將細胞以每孔1×104接種于96孔板，在細胞培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)24 h。細胞分別與終濃度為0（細胞對照組），2.5，5，10，15，20，30，40，50，60，80 和100 μmol·L-1的CdCl2共孵育24 h 后，每孔加入10 μL CellTiter-Blue?檢測試劑，繼續(xù)孵育4 h，于560 和590 nm 雙波長下測吸光度（absorbance，A）值[19]。各組設5 個復孔，實驗重復3 次。細胞存活率（%）=（Cd 處理組A 值/對照組A 值）×100%，用Logit 法計算CdCl2抑制細胞存活的半數抑制濃度（IC50）。

1.7 流式細胞術檢測體外培養(yǎng)小鼠十二指腸上皮細胞的細胞周期

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細胞。將細胞以每孔5×105接種于6 孔板，在細胞培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)24 h。根據1.6 所得的IC50值和預實驗結果，將細胞隨機分為細胞對照組和CdCl215 μmol·L-1處理組，分別給藥孵育24 h 后，胰酶消化細胞。按細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒操作說明向細胞懸液中加入碘化丙啶染色液，37℃避光溫育30 min，于流式細胞儀上檢測細胞周期[20]。每組設2 個復孔，實驗重復3 次。

1.8 Western 印跡法檢測體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞中活化的胱天蛋白酶3蛋白表達水平

取正常小鼠，按1.3和1.4制備和鑒定十二指腸上皮細胞。將細胞以每孔4×105接種于6 孔板，在細胞培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)24 h。根據1.6 所得IC50和預實驗結果，細胞隨機分為細胞對照組和CdCl230 μmol·L-1處理組，分別給藥孵育3，6，9 和12 h后，收集細胞，加入200 μL 細胞裂解液，4℃裂解細胞2 h，提取細胞總蛋白。經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜上，封閉2 h，加活化的胱天蛋白酶3（1∶500）和β 肌動蛋白（1∶3000）一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶5000），室溫孵育2 h后ECL 發(fā)光法顯影，用ImageJ 1.42 軟件分析各蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以目標蛋白與內參蛋白IA 比值反映目標蛋白的相對表達量[21]。實驗重復3 次。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 急性和慢性Cd中毒對小鼠生存的影響

慢性Cd中毒小鼠染毒后7 d內無死亡，且小鼠活動正常（數據略）。急性Cd中毒小鼠在染毒第1天即出現萎靡不振，進食減少的狀況；第2天部分動物出現四肢抽搐、行動障礙和死亡；隨著時間延長，小鼠生存率逐漸下降，第5天時小鼠生存率降至40%，第6和第7天生存率維持不變（圖1）。

Fig.1 Survival curve of mice with acute cadmium（Cd）poisoning. Mice were ig given a single dose of CdCl2 80 mg·kg-1 or saline（normal control，NC），and the survival status of mice was recorded for 7 d.

2.2 十二指腸上皮細胞的鑒定

如圖2 所示，本實驗分離制備的小鼠十二指腸上皮細胞多呈扁平短梭狀，貼壁生長。經E-鈣黏蛋白免疫熒光染色特異性標記后呈現綠色熒光，占細胞總數＞95%，可用于后續(xù)實驗。

2.3 急性或慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細胞中Cd離子含量

結果如圖3所示，急性或慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細胞的熒光強度相比于各自正常對照組均顯著增加（P＜0.01），表明Cd 離子在急、慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細胞中顯著富集。

Fig.2 ldentification of primary duodenal epithelial cells by E-cadherin immunofluorescence staining. The duodenal epithelial cells were separated from mouse duodenum by collagenase Ⅺand cultured in complete medium for 3-4 d. Light microscopy and immunofluorescence image of duodenal epithelial cells that were stained with DAPI（blue）and E-cadherin（green）.

Fig.3 Cd2+content in duodenal epithelial cells of mice with acute and chronic cadmium poisoning by confocal fluorescence detection. Chronic cadmium poisoning model：mice were ig administered with CdCl2 10 mg·kg-1 once per day for 30 d；acute cadmium poisoning model：mice were ig administered with single dose of CdCl2 80 mg·kg-1. After 24 h of the last administration，the duodenal epithelial cells were separated and cultured as described in Fig.2. Cells were incubated with Leadmium Green AM dye（5 mg·L-1）for 30 min，and fluorescence intensity（FI）was detected（A）. B was the quantitative result of A.x±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group.

2.4 Cd 對體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞存活的影響

如圖4 所示，CdCl2作用24 h 對十二指腸上皮細胞活力具有抑制作用，且抑制作用隨濃度的增加逐漸增強。其IC50值為（24.55±0.84）μmol·L-1。

Fig.4 Effect of CdCl2 on viability of mouse duodenal epithelial cells in vitro by CellTiter-Blue?assay. See Fig.2 for the duodenal epithelial cell treatment. Cells were treated with CdCl2 0（cell control），2.5，5，10，15，20，30，40，50，60，80 and 100 μmol·L-1 for 24 h. Cell viability（%）=〔（A560/590 nm of CdCl2-treated group/A560/590 nm of control group〕×100%.±s，n=3.

2.5 Cd 對體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞細胞周期的影響

實驗結果（圖5）表明，相對于細胞對照組，CdCl215 μmol·L-1處理組細胞G0/G1期比例顯著增加（P＜0.05），S 期和G2/M 期比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示CdCl2可使十二指腸上皮細胞細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制DNA 合成，從而抑制細胞增殖。

Fig.5 Effect of CdCl2 on cell cycle of mouse duodenal epithelial cells detected by flow cytometry. The duodenal epithelial cells were treated with CdCl2 15 μmol·L-1 for 24 h.B was the quantitative result of A.，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 Cd 對體外培養(yǎng)的小鼠十二指腸上皮細胞中活化的胱天蛋白酶3蛋白表達水平的影響

檢測結果（圖6）顯示，與細胞對照組相比，隨著CdCl2處理時間的增加，十二指腸上皮細胞活化的胱天蛋白酶3 表達水平逐漸增加。CdCl2處理6，9和12 h的上皮細胞相對于對照組（0 h）活化的胱天蛋白酶3顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），提示CdCl2可使十二指腸上皮細胞中活化的胱天蛋白酶3表達量增加，從而引發(fā)細胞凋亡。

Fig.6 Effect of CdCl2 on expressions of cleaved-caspase 3 protein in mouse duodenal epithelial cells by Western blotting. Cells were treated with CdCl2 30 μmol·L-1 for 3，6，9 and 12 h.B was the semi-quantitative result of A.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 h）group.

3 討論

研究發(fā)現，一次性ig 給予高劑量的Cd 在短期內會對小鼠造成嚴重的損傷，并且急、慢性Cd中毒小鼠十二指腸上皮細胞Cd 離子含量均顯著增加；在離體實驗中，Cd以濃度依賴方式降低十二指腸上皮細胞活力，提示經消化道進入體內的Cd 對十二指腸上皮細胞造成損傷，且這種損傷作用可能涉及到細胞周期阻滯和胱天蛋白酶3介導的細胞凋亡。

需要指出的是，關于急性Cd中毒的ig劑量，國內外報道很少，曾有文獻報道，小鼠Cd經口急性毒性LD50為150 mg·kg-1[12]，本實驗室前期采用6 周齡C57BL/6小鼠預實驗發(fā)現，CdCl2150 mg·kg-1的劑量對小鼠傷害過大，腸胃道損傷嚴重，不利于后期原代細胞分離培養(yǎng)等實驗的進行。根據預實驗結果，并參照Zhao 等[11]和Yang 等[13]的ig 劑量，本實驗采用單次ig給予CdCl280 mg·kg-1的劑量建立急性Cd 中毒模型，染毒期間小鼠隨染毒天數增加逐漸顯示出萎靡不振，飲食減退，并死亡的現象，穩(wěn)定地體現了小鼠每個中毒階段的反應。

Cd 經口進入體內，主要消化吸收的部位在小腸，而十二指腸是小腸吸收的重要的腸段。研究發(fā)現，急、慢性Cd中毒小鼠的十二指腸上皮細胞中都富集了大量的Cd離子，這些Cd離子的富集可能會直接打破細胞本身的離子平衡進而引發(fā)細胞損傷[22]。胱天蛋白酶家族在細胞凋亡的調控網絡中起到關鍵性作用[23]，其中胱天蛋白酶3 是凋亡執(zhí)行蛋白，在細胞凋亡早期的啟動與執(zhí)行過程中起重要作用，是細胞凋亡發(fā)生的關鍵酶[24]。胱天蛋白酶3的激活常被作為細胞凋亡的一個重要指標[25]。本研究結果表明，隨著CdCl2暴露時間的增加，十二指腸上皮細胞中活化的胱天蛋白酶3 表達量逐漸增加，表明細胞啟動了凋亡程序。細胞周期同細胞凋亡的發(fā)生密切相關，對細胞周期的調控能阻止或促進細胞凋亡的發(fā)生[26]。本研究表明，Cd可使十二指腸上皮細胞G0/G1期細胞比例增多，而S 期和G2/M期細胞比例相對減少，可能是因為Cd 對十二指腸上皮細胞DNA損傷較重，超出了機體細胞正常存在的損傷修復調控體系的修復能力，進而促進細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究利用在體動物和離體細胞研究發(fā)現，Cd誘導小鼠十二指腸上皮細胞損傷的內在機制可能涉及到胱天蛋白酶3 介導的細胞凋亡，以及細胞周期阻滯，為Cd 中毒患者的治療和后期護理提供了一定的理論依據。