張惠娟，余飛艷，張榮光，段廣才

1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)療保健科，海南 ?？?570102； 2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)在全球人群的感染率超過50%，H.pylori感染可引起包括胃癌在內(nèi)的多種胃腸疾病和腸外疾病，其致病機制不明，抗生素治療H.pylori感染面臨抗藥性不斷升高的挑戰(zhàn)，而相關(guān)疫苗雖有進入臨床試驗報道，但事實上至今仍無商品化產(chǎn)品問世，因此，H.pylori感染流行的防治已成為重大公共衛(wèi)生問題[1-4]。H.pyloriUreB蛋白既是細菌的主要毒力因子，也是重要的保護性抗原[5-6]。目前，有研究顯示，用UreB免疫人和實驗動物均可產(chǎn)生免疫保護效果，但其機制尚不明確[7]。因此，本研究初步探討UreB對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1H.pyloriUreB蛋白制備采用本室前期構(gòu)建的重組菌株E.coliTB1/pMAL-c2x-UreB，用IPTG誘導(dǎo)重組菌株表達UreB，并通過多糖樹脂親和層析純化重組蛋白(rUreB)，將純化產(chǎn)物置于-80 ℃儲存?zhèn)溆肹8]。

1.2 試劑和實驗動物采用雙色標記的單抗CD4+FITC/CD3+PE(Serotec Co.)和FACS溶血素(晶美生物公司)進行流式細胞分析。3周齡雄性昆明小鼠由河南省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)1周后，用于免疫實驗。

1.3 動物分組及處理將實驗動物隨機分成實驗組和對照組，實驗組(n=20)經(jīng)背部皮下注射重組蛋白液100 μl (0.50 g/L)，對照組(n=20)注射等體積過柱緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L β巰基乙醇)。

1.4 血液樣品采集于注射UreB后1周和2周，每組分別抽取7只和13只小鼠，經(jīng)眼球采集血液。對采血用的1.5 ml EP管預(yù)先用質(zhì)量濃度為38 g/L的枸櫞酸鈉溶液浸潤處理，并于臨用前在管底預(yù)加30 μl此溶液。在血液滴入后，溫和振蕩，使枸櫞酸鈉與血液充分混勻，用于后續(xù)流式細胞檢測。

1.5 血液白細胞(WBC)和紅細胞(RBC)計數(shù)采用臨床血常規(guī)自動化檢測設(shè)備，對小鼠抗凝血中WBC和RBC進行計數(shù)。

1.6 流式細胞檢測取100 μl抗凝血，加入8 μl CD4+FITC/CD3+PE單抗(商品打開包裝后，用1 ml蒸餾水稀釋，10 μl/test×100 tests)，混勻，避光孵育30 min。加入1×FACS溶血素2 ml混勻，室溫，避光孵育15 min，至液體澄清透明。然后1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入2 ml PBS洗液(PBS+質(zhì)量濃度為10 g/L的FBS+質(zhì)量濃度為1 g/L的NaN3)混勻，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。將細胞懸浮于0.5 ml PBS洗液中，振蕩混勻，用流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié)果

2.1H.pyloriUreB蛋白應(yīng)用本課題組前期報道重組菌株和方法[8]，從重組菌誘導(dǎo)表達產(chǎn)物中純化得到rUreB蛋白，純化產(chǎn)物純度約為90%。實驗過程中均無小鼠死亡。

2.2 動物免疫免疫實驗組和對照組小鼠均完成實驗過程。每只小鼠經(jīng)摘眼球采血300～400 μl。實驗過程中均無小鼠死亡。

2.3 全血細胞計數(shù)小鼠抗凝血WBC計數(shù)結(jié)果顯示，實驗組WBC計數(shù)高于對照組，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RBC計數(shù)結(jié)果顯示，兩組的RBC均數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 小鼠血液WBC和RBC計數(shù)Tab 1 WBC and RBC counts of the mice blood samples

2.4 流式細胞分析流式檢測結(jié)果顯示，在免疫后1周，rUreB免疫組小鼠CD3+CD4-T淋巴細胞(CD4-)和CD3+T淋巴細胞(CD3+)在總淋巴細胞(LC)中各自所占構(gòu)成比均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而在免疫后第2周，此指標差異不再具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2 H.pylori rUreB免疫小鼠血液淋巴細胞亞群與總淋巴細胞比值Tab 2 Ratio of lymphocyte subgroup and total lymphocytes in mice immunized with H.pylori rUreB protein

注：與Buffer組相比，△P<0.05；CD4+：CD3+CD4+T淋巴細胞；CD4-：CD3+CD4-T淋巴細胞；CD3+：CD3+T淋巴細胞；LC：總淋巴細胞。

免疫實驗組CD4+CD3+T淋巴細胞與CD4-CD3+T淋巴細胞比值、CD3+CD4+T淋巴細胞與CD3+T淋巴細胞比值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

免疫實驗組CD3+CD4+T淋巴細胞與WBC比值、CD3+CD4-T淋巴細胞與WBC比值、CD3+T淋巴細胞與WBC比值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表3 H.pylori rUreB免疫小鼠血液不同淋巴細胞亞群比值Tab 3 Ratio of lymphocyte subgroups in mice immunized with H.pylori rUreB

表4 H.pylori rUreB免疫小鼠血液淋巴細胞亞群與WBC比值Tab 4 Ratio of lymphocyte subgroups and WBC in mice immunized with H.pylori rUreB

3 討論

已有研究顯示，H.pylori某些抗原具有影響宿主免疫功能的作用，其中包括改變宿主免疫細胞亞群比勢。例如，H.pyloriOmp18蛋白能夠顯著提高樹突狀細胞的MHC Ⅱ類抗原和共刺激因子CD83的表達，促進樹突狀細胞發(fā)育成熟和Th1/Th2類免疫反應(yīng)，進而提升人體CD4+T細胞數(shù)量；H.pylori中性粒細胞激活蛋白(NapA)具有促進Th2型免疫反應(yīng)向Th1型轉(zhuǎn)化的免疫調(diào)節(jié)功能，在抗過敏和抗腫瘤研究中具有潛在應(yīng)用價值[9-10]。然而，關(guān)于H.pyloriUreB蛋白免疫調(diào)節(jié)活性的研究尚少有報道。

H.pylori主要定植于人體胃黏膜黏液層，生存于酸性較強的環(huán)境中。H.pylori尿素酶是菌體分泌產(chǎn)生的主要功能蛋白，可以分解消化道內(nèi)的尿素產(chǎn)生氨，藉此中和菌體周圍環(huán)境中的胃酸，使菌體得以長期在胃內(nèi)存活。H.pylori尿素酶由UreB和UreA兩種亞單位構(gòu)成，其中，UreB具有良好的免疫原性且毒性較UreA低，因此常被用作疫苗抗原[11]。據(jù)報道，UreB與黏膜免疫佐劑LTB經(jīng)口免疫實驗動物，可增強動物對H.pylori攻擊的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的免疫保護效果[12]。研究提示，UreB蛋白可能在H.pylori感染免疫和致病機制中具有重要作用。目前，H.pylori感染致病機制和免疫保護機制不明是制約H.pylori感染防治研究發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此，本研究探討UreB對宿主免疫的影響具有重要意義。

已有研究基于建立黏膜免疫保護目的，多將H.pyloriUreB蛋白與黏膜佐劑混合，經(jīng)口免疫實驗動物。這種免疫方法適用于口服疫苗免疫效果的鑒定，但不利于對UreB蛋白免疫調(diào)節(jié)活性的分析[13]。經(jīng)皮下注射UreB蛋白可以減少黏膜佐劑和胃腸環(huán)境因素對UreB蛋白生物效應(yīng)的混雜作用，因此，本研究采用經(jīng)皮下注射UreB蛋白的免疫途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然H.pyloriUreB免疫組小鼠血液RBC和WBC計數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在免疫后1周，免疫組小鼠的CD4-CD3+T細胞與總淋巴細胞比值、CD3+T細胞與總淋巴細胞比值均顯著低于對照組。研究表明，H.pyloriUreB對宿主免疫細胞亞群的構(gòu)成比具有調(diào)節(jié)作用。由于CD4-CD3+T細胞中主要是CD8+CD3+T淋巴細胞亞群，且該亞群以抑制性T細胞(Ts)和細胞毒性T細胞(Tc)為主，因此，UreB降低小鼠的CD4-CD3+T細胞與總淋巴細胞比值可能是UreB增強宿主抗H.pylori感染免疫機制之一。

在免疫后第2周，免疫組小鼠的CD4-CD3+T細胞與總淋巴細胞比值、CD3+T細胞與總淋巴細胞比值均與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，研究提示，H.pyloriUreB對宿主免疫細胞亞群的構(gòu)成比的調(diào)節(jié)作用具有明顯的時效性特征。這種時效性的存在給研究提出一個問題：類似UreB的H.pylori保護性抗原可能對宿主的免疫調(diào)節(jié)效果相當短暫，例如，本研究發(fā)現(xiàn)，UreB的調(diào)節(jié)效果僅持續(xù)約1周時間，鑒于此，未來研究如何提高其免疫調(diào)節(jié)作用并長期維持免疫效果？這個問題值得在后續(xù)研究中進行深入探討。

總之，本研究通過用H.pyloriUreB蛋白經(jīng)皮下免疫小鼠實驗，鑒定了該蛋白對小鼠免疫細胞亞群數(shù)量比值的影響，發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果為H.pylori感染免疫和致病機制研究奠定了重要基礎(chǔ)。