劉 培， 梁 坤， 楊玉玲， 孫力文， 邊 城， 江月萍， 姜相君

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，山東 青島266555； 2.青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科

惡性腫瘤治療困難和預(yù)后不良的主要原因在于其易侵襲、轉(zhuǎn)移，這也是胃癌死亡率居高不下的原因，胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移與胃癌細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。 BTG3蛋白屬于抗增殖基因家族成員[1]，是潛在的抑癌基因，研究顯示，BTG3蛋白在多種腫瘤中表達(dá)降低，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲起負(fù)向調(diào)控作用[2-4]，但其在胃癌中相關(guān)表達(dá)調(diào)控因素尚未闡明。miR-106b作為微小RNA，研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)可導(dǎo)致胃癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生[5-6]，有報(bào)道顯示，其可通過調(diào)控BTG3蛋白的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的生長增殖[7]，在胃癌細(xì)胞中兩者之間的關(guān)系需要進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過分析胃癌、癌旁、癌前病變組織及對(duì)照組石蠟標(biāo)本中BTG3蛋白表達(dá)情況，探討B(tài)TG3蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。通過分析miR-106b在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)BTG3蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討B(tài)TG3蛋白在胃癌中的相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑胃癌細(xì)胞株SGC-7901、正常永生化的胃壁細(xì)胞株GES-1購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒北京中杉金橋；Lipofectamine 2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自TaKaRa公司，miR106b模擬劑及抑制劑由GenePharma公司合成。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液購自Beyotime公司；PVDF膜購自Millipore公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher公司；兔抗人BTG3一抗、兔抗人β-actin一抗、山羊抗兔二抗購自Abcam公司；熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自Promega 公司；熒光素酶報(bào)告載體Promega 公司合成。

選取2014年6月至2016年8月青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市市立醫(yī)院病理室存檔的石蠟標(biāo)本，包括手術(shù)切除胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織120對(duì)(癌旁組織取自距癌組織邊界5 cm)，男72例，女48例，年齡(55±0.5)歲(32～75歲)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；低分化腺癌56例，中分化腺癌34例，高分化腺癌30例；H.pylori陽性69例，H.pylori陰性51例。同期慢性萎縮性胃炎伴上皮內(nèi)瘤變(伴或不伴腸化生)組織116例為癌前病變組，男54例，女62例，年齡(56±0.5)歲(35～72歲)，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變61例，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變55例。胃鏡活檢的淺表性胃炎石蠟標(biāo)本110例作為對(duì)照組，男66例，女44例，年齡(53±0.5)歲(28～75歲)。所有胃癌患者術(shù)前未行化療、放療和其他輔助治療，并確認(rèn)手術(shù)標(biāo)本切緣為陰性，癌前病變組織所對(duì)應(yīng)患者均無其他合并癥，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化及結(jié)果判定：石蠟包埋的各胃黏膜組織，包括胃癌組織、癌旁組織、癌前病變組織及對(duì)照組織，常規(guī)行石蠟切片，厚4 μm。按照S-P免疫組化染色試劑盒說明書操作，光鏡下計(jì)數(shù)和拍照，觀察BTG3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判定：BTG3蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。檢查組織染色強(qiáng)度：按切片中細(xì)胞顯色有無及染色深淺記分，細(xì)胞無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。檢查腫瘤細(xì)胞陽性染色比例：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。然后按照“染色深淺程度×陽性細(xì)胞得分”計(jì)總分(0分，-；1～2分，+；3～5分，++；6～9分，+++)。用已知陽性片和PBS代替一抗分別作為陽性對(duì)照及空白對(duì)照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞株SGC-7901及人胃黏膜細(xì)胞GES-1培養(yǎng)體系為質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的1640培養(yǎng)液，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，37 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將生長90%匯合的細(xì)胞加入質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞中BTG3、miR-106b表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。mRNA采用M-MLV操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miRNA采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)，延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，95 ℃變性1 min，后冷卻至55 ℃，制作熔解曲線分析。mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miRNA以U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析，所用引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.4 Western blotting檢測(cè)BTG3蛋白表達(dá)：miR-106b 模擬物及抑制物分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901，收集轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入RIPA裂解液，進(jìn)行蛋白定量，95 ℃加熱變性，對(duì)樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗二抗孵育后，用ECL方法顯色，獲取BTG3蛋白質(zhì)信號(hào)條帶圖像并分析。用目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值之比即為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)BTG3與miR-106b的結(jié)合位點(diǎn)并體外克隆擴(kuò)增，設(shè)計(jì)具有預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的BTG3-3′UTR 野生序列或突變序列，構(gòu)建入pGL3-basic載體中，突變的3′-UTR區(qū)作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前1 d將SGC7901細(xì)胞種植到24孔板(2×104個(gè)/孔)上，并與構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體(0.5 μg)和20 μmol/L miR-106b 模擬物或陰性對(duì)照模擬物共轉(zhuǎn)染，使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行光密度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。t檢驗(yàn)用于兩項(xiàng)指標(biāo)間的比較，單因素方差分析用于多項(xiàng)指標(biāo)間的比較，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/%表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胃黏膜組織中BTG3的表達(dá)BTG3蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色或棕色顆粒(見圖1)。BTG3陽性表達(dá)率分別為胃癌組 32.50%(39/120)、癌旁組65.00%(78/120)，慢性萎縮性胃炎組60.34%(70/116)、淺表性胃炎對(duì)照組71.82%(79/110)。胃癌組BTG3蛋白表達(dá)率較低，與其他各組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。癌旁組、慢性萎縮性胃炎組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 胃癌及癌旁組織BTG3蛋白表達(dá)(S-P免疫組化染色) A:胃癌(100×)；B:癌旁組織(100×);C:胃癌(300×);D:癌旁組織(300×)Fig 1 Expression of BTG3 protein in gastric cancer and adjacent tissues (SP immunohistochemical staining) A: gastric cancer (100×);B: adjacent tissues (100×); C: gastric cancer (300×);D: adjacent tissues (300×)

2.2 BTG3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的分析120例患者胃癌組織按臨床病理特征分組比較，結(jié)果顯示，BTG3蛋白表達(dá)與胃癌腫瘤分期(P=0.041)及腫瘤分化程度(P=0.021)有關(guān)，胃癌分期越晚或腫瘤分化程度越低，BTG3蛋白表達(dá)也隨著明顯降低;與年齡(P=0.581)、性別(P=0.524)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(P=0.275)無明顯相關(guān)性，本課題組首次分析了胃癌中H.pylori感染與BTG3蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，H.pylori陽性胃癌組織中BTG3蛋白表達(dá)率與H.pylori陰性組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)(見表2)。

表2 BTG3蛋白表達(dá)與臨床病理特征分析Tab 2 Expression of BTG3 protein and analysis of clinicopathological features

2.3 BTG3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，BTG3 mRNA在胃癌細(xì)胞SGC-7901組(0.43±0.24)、永生化胃壁細(xì)胞GES-1組(1.137±0.58)、胃癌細(xì)胞中BTG3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見圖2)。

2.4 miR-106b在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)miR-106b mRNA在胃癌細(xì)胞SGC-7901組(4.099±0.115)、永生化胃壁細(xì)胞組(1.037±0.034)，miR-106b在胃癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平較高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見圖2)。

注：*P<0.001。

2.5 上調(diào)及下調(diào)胃癌細(xì)胞中miR-106b對(duì)BTG3蛋白表達(dá)的影響將miR-106b模擬物(miR-106b-mimic)及抑制物(miR-106b-ASO)分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901，采用Western blotting方法檢測(cè)BTG3蛋白表達(dá)差異。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物后，胃癌細(xì)胞miR-106b表達(dá)上調(diào)，而BTG3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，轉(zhuǎn)染miR-106b抑制物后，胃癌細(xì)胞miR-106b表達(dá)下調(diào)，而BTG3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)，結(jié)果提示BTG3受miR-106b負(fù)調(diào)控(見圖3)。

注：*P<0.001。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)為了研究miR106b在胃癌細(xì)胞SGC-7901中是否直接調(diào)控BTG3表達(dá)，設(shè)計(jì)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，將pGL3-BTG3-3′UTR或pGL3-BTG3-3′UTR mut與miR-106b模擬物(或模擬物陰性對(duì)照)共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901，采用熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行檢測(cè)。BTG3-3′UTR與miR-106b結(jié)合區(qū)序列及突變位點(diǎn)如圖4所示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物后，含有野生型BTG3-3′UTR的報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性明顯下降(P<0.001)；含有突變型BTG3-3′UTR報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，結(jié)果提示在基因水平上BTG3受miR-106直接調(diào)控。

注：*P<0.001。

3 討論

BTG3屬于BTG/Tob(B-cell translocation gene/transducer of erbB2，B細(xì)胞遷移基因/erbB2轉(zhuǎn)錄因子)家族，具有抑制細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞生長、促使細(xì)胞分化、參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)等功能。文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]顯示，BTG3在胃癌等多種腫瘤中表達(dá)降低，但在胃癌前病變組織中研究較少，本研究選取癌前病變組織為慢性萎縮性胃炎伴上皮內(nèi)瘤變組織，通過免疫組化方法研究胃癌組及癌前病變等組織中BTG3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，BTG3 蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，慢性淺表性胃炎對(duì)照組織及癌前病變組織均有不同程度的表達(dá)，兩組BTG3蛋白表達(dá)無明顯差別，而胃癌組織中BTG3蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，與既往研究[2-4]一致。與胃癌各臨床病理特征研究中發(fā)現(xiàn)，BTG3蛋白表達(dá)與胃癌腫瘤分期及分化程度有關(guān)，腫瘤組織的分化程度越低，胃癌分期越晚，BTG3蛋白的表達(dá)也越低。另外qPCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中BTG3表達(dá)也較低，故本研究證實(shí)BTG3低表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外本研究首次分析了胃癌中H.pylori感染與BTG3蛋白表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BTG3在H.pylori陽性的胃癌組織比H.pylori陰性組織中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其間相關(guān)聯(lián)系需要深入研究。

BTG3雖在多種腫瘤中表達(dá)異常，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。miRNA作為新的基因調(diào)控的形式，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[8]，miR-106b在多種腫瘤中已做探討，如在膠質(zhì)瘤中通過靶向調(diào)控RBL1、RNL2和CASP8發(fā)揮直接的促癌作用[9]。在喉癌中通過影響RUNX3來對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲調(diào)控[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞SGC-7901中miR-106b表達(dá)較高。有研究[7]發(fā)現(xiàn)其非小細(xì)胞肺癌中可通過調(diào)控BTG3在發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)探討其在胃癌細(xì)胞中是否也能調(diào)控BTG3。Westen blotting方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞SGC-7901中上調(diào)或下調(diào)胃癌細(xì)胞miR-106b后，BTG3蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)降低或升高，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-106b模擬劑后報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性降低。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在胃癌細(xì)胞中miR-106b可負(fù)性調(diào)控BTG3表達(dá)，BTG3與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，故miR-106b有可能通過BTG3來發(fā)揮其對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性調(diào)控。

綜上所述，BTG3在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，與miR-106b關(guān)系密切，表達(dá)受miR-106b直接調(diào)控。對(duì)BTG3上下游調(diào)控基因的探討，有利于闡明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制，有可能成為胃癌基因治療新靶點(diǎn)。