杜 娟， 陳亞妮， 史海燕， 王愛紅， 殷松娜， 趙菊梅

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000

最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：全球范圍內(nèi)，每年約有1 033 701例新增胃癌患者(占癌癥總發(fā)病率的5.7%)，是發(fā)病率位居第六位的腫瘤；相對于胃癌的發(fā)病率，其死亡率較高，繼肺癌和結(jié)腸癌后死亡率位居第三位(每年約有78 265例胃癌患者死亡，占癌癥總死亡率的8.2%)的惡性腫瘤[1]。在我國，胃癌每年的新增病例約41萬，死亡病例約29.4萬，是發(fā)病率僅次于肺癌、死亡率位居第三位(肺癌和肝癌之后)的惡性腫瘤[2-3]。胃癌較高的發(fā)病率和死亡率已使其成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。然而，胃癌屬于異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、飲食和地域等多種因素。在胃癌發(fā)生過程中，患者早期的癥狀不明顯，臨床上非侵入性檢測方法相對缺乏，檢出率較低；進(jìn)入進(jìn)展期后，手術(shù)及手術(shù)聯(lián)合放化療等治療方式往往不能全面、有效地控制腫瘤的生長，患者的治療和預(yù)后差。因此，如何提高胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測效率是一個亟待解決的問題。

蛋白質(zhì)是機(jī)體生命活動的體現(xiàn)者，在過去的幾十年中，腫瘤相關(guān)研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因上。然而，蛋白質(zhì)編碼序列在基因組序列中的比例僅為2%左右，其他90%以上的轉(zhuǎn)錄序列，即非編碼RNA(包括miRNA、siRNA、piRNA、LncRNA等)，并不產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物。在過去很長一段時間內(nèi)，非編碼RNA的功能均未被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是不具生物功能的“垃圾”產(chǎn)物。然而，隨著研究手段的不斷提高，miRNA、siRNA及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)等被發(fā)現(xiàn)在機(jī)體生長、發(fā)育，細(xì)胞生長、凋亡，癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[4-6]，可能作為癌癥診斷和治療的潛在標(biāo)志物和靶標(biāo)[7]。

LncRNA是近年來研究較多的具有細(xì)胞組織特異性、時空特異性和種屬特異性的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其片段長度通常>200 nt。在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中，已有研究顯示：LncRNA能夠通過引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、參與表觀遺傳學(xué)修飾、介導(dǎo)miRNA沉默等方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、遷移[8]。然而，LncRNA種類和數(shù)量較多，大多數(shù)LncRNA的作用及其臨床意義還不明確。在前期LncRNA表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，基因間長鏈非編碼RNA(intergenic LncRNA，LINCRNA)LINC00858(位于10q23.1上，長度為2 685 nt)在腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌和骨髓癌中的表達(dá)量較癌旁組織低，而在其他種類腫瘤組織中的表達(dá)量較癌旁組織高。且有報道顯示，提高LINC00858的表達(dá)量能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[9-11]。然而，還未見LINC00858表達(dá)量與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的研究報道。本研究擬通過檢測LINC00858在胃癌組織中表達(dá)量的變化，探討LINC00858表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究材料以實驗室保存的20例人胃癌組織及其配對癌旁正常組織(經(jīng)病理切片證實)為材料。所選20例患者經(jīng)調(diào)查均無家族性遺傳病史，且檢查無其他部位原發(fā)腫瘤。患者基本情況如下：20例患者中，男10例，平均年齡64.9歲(46～86歲)；女10例，平均年齡67歲(48～78歲)。本研究通過科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，并遵守患者知情同意原則。

1.2 主要試劑與儀器總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司(英國)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司(日本)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑購自康潤生物(中國)；qRT-PCR定量引物由本實驗室設(shè)計(具體序列見表1)，奧科鼎盛生物科技有限公司(中國，楊凌)合成。研究所用qRT-PCR儀為Cobas Z480(Roche，美國)。

表1 qRT-PCR定量引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequences

1.3 TCGA數(shù)據(jù)分析首先，用在線軟件Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析不同類型腫瘤及其對應(yīng)癌旁組織中LINC00858的表達(dá)情況。其次，用GEPIA分析胃癌患者LINC00858表達(dá)量與患者總生存期和無病生存期的關(guān)系。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成分別取各組織樣品于預(yù)冷研缽中，液氮研磨，Trizol裂解各腫瘤及其配對癌旁組織細(xì)胞，氯仿萃取、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌后ddH2O溶解獲得總RNA。酶標(biāo)儀檢測總RNA濃度和純度(OD260/OD280)濃度，合格后，取1 μg總RNA按試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄所用引物為隨機(jī)引物)合成cDNA。

1.5 qRT-PCR法檢測LINC00858的表達(dá)量以U6為內(nèi)部參照基因，按試劑說明書配制qRT-PCR反應(yīng)液，qPCR檢測患者腫瘤組織中LINC00858的相對表達(dá)量(以配對癌旁正常組織為對照)。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3 min，(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)×40個循環(huán)，95 ℃ 5 s，(60 ℃ 1 min，持續(xù)升溫至95 ℃，熒光檢測間隔為5 ℃)。LINC00858在腫瘤組織中的相對表達(dá)量用2-△△CT表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用Prism 7.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)采用非參數(shù)Mann-WhitneyT檢驗，統(tǒng)計量用Mann-Whitney U表示；多組數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis進(jìn)行分析，統(tǒng)計量用Kruskal-Wallis statistic表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在線數(shù)據(jù)分析LINC00858表達(dá)量在不同腫瘤患者組織中的表達(dá)變化用在線軟件GEPIA分析LINC00858在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示：LINC00858在三種腎癌組織(腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌)和骨髓癌中的表達(dá)量呈下降趨勢，在其他多種腫瘤組織如胃癌、肺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等組織中表達(dá)量呈上升趨勢。該結(jié)果提示，LINC00858的表達(dá)變化可能具有組織特異性：在腎臟相關(guān)腫瘤及骨髓癌中的特異性呈下降趨勢，在胃癌及其他類型腫瘤中呈上升趨勢。

注：ACC，腺樣囊性癌；BLCA，膀胱癌；BRCA，乳腺癌；CESC，宮頸鱗癌和腺癌；CHOL，膽管癌；COAD，結(jié)直腸癌；DLBC，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；ESCA，食管癌；GBM，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；HNSC，頭頸鱗狀細(xì)胞癌；KICH，腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC，腎透明細(xì)胞癌；KIRP，乳頭狀腎細(xì)胞癌；LAML，急性髓細(xì)胞樣白血??；LGG，腦膠質(zhì)瘤；LIHC，肝癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鱗狀細(xì)胞癌；OV，卵巢癌；PAAD，胰腺癌；PCPG，腎上腺癌；PRAD，前列腺癌；READ，直腸腺癌；SARC，軟組織癌；SKCM，皮膚癌；STAD，胃癌；TGCT，睪丸癌；THCA，甲狀腺；THYM，胸腺癌；UCEC，子宮內(nèi)膜癌；UCS，子宮癌。

圖1 LINC00858在不同腫瘤組織及其配對癌旁正常組織中的表達(dá)情況
Fig 1 Expression of LINC00858 in different tumor types compared with that in normal adjacent tissues

2.2 LINC00858表達(dá)量與胃癌患者生存期及臨床分期相關(guān)性分析為明確LINC00858與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，研究用GEPIA對LINC00858表達(dá)量變化與胃癌患者生存期間的關(guān)系進(jìn)行了分析：低LINC00858表達(dá)患者的總生存期[LogrankP=0.046，P(HR)=0.047]和無病生存期[LogrankP=0.0076，P(HR)=0.0086]較高LINC00858表達(dá)患者長(見圖2A、2B)。進(jìn)一步對LINC00858表達(dá)量與胃癌患者臨床分期進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著病情的發(fā)展，LINC00858在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ不同分期中表達(dá)量呈上升趨勢，即LINC00858表達(dá)量越高，患者的臨床分期越晚[Pr(>F)=0.0487](見圖2C)。因此，胃癌患者腫瘤組織中LINC00858表達(dá)量升高可能促進(jìn)疾病的進(jìn)展，與患者的不良預(yù)后相關(guān)。

圖2 LINC00858表達(dá)量與胃癌患者生存期、臨床分期的關(guān)系 A：總生存期；B：無病生存期；C：臨床分期Fig 2 Relationship of expression of LINC00858 with gastric cancer patients’ survival and clinical stage A: overall survival; B: disease-free survival; C: clinical stage

2.3 LINC00858在胃癌及其癌旁正常組織中的表達(dá)為進(jìn)一步明確LINC00858在胃癌組織中的表達(dá)情況，研究用qRT-PCR法檢測了20例胃癌患者的癌組織及其癌旁正常組織中LINC00858的表達(dá)量,結(jié)果顯示不同胃癌患者LINC00858的表達(dá)變化存在差異(見圖3A)，但在整體水平上，LINC00858在癌組織中的表達(dá)量較癌旁正常組織高(P=0.0230，見圖3B)，即LINC00858表達(dá)量的升高與胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)。

圖3 LINC00858在不同患者的胃癌及其癌旁正常組織中的表達(dá)情況A：qRT-PCR分別檢測20例胃癌患者癌組織及癌旁常組織中LINC00858的表達(dá)情況；B：整體水平上檢測20例胃癌患者癌組織及癌旁正常組織中LINC00858的表達(dá)情況

Fig 3 Expression changes of LINC00858 in different gastric cancer tissues compared with that in normal adjacent tissuesA: expressions of LINC00858 in different gastric cancer patients’tumor tissue and normal adjacent tissues detected by qRT-PCR;B: overall expression of LINC00858 in gastric cancer tissues and normal adjacent tissues

2.4 LINC00858表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性的分析不同性別、不同年齡胃癌患者LINC00858的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者腫瘤組織中LINC00585表達(dá)水平較Ⅲ+Ⅳ期低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,見表2)，即LINC00858表達(dá)水平可能與患者疾病的發(fā)展相關(guān)，LINC00858表達(dá)量增加對腫瘤的生長、侵襲和遷移具有促進(jìn)作用。

3 討論

目前，人類基因組中已經(jīng)鑒定出的LncRNA數(shù)量超過56 000種，而根據(jù)其所處基因組位置的不同可分為LINCRNA、反義LncRNA、正義RNA、內(nèi)含子LncRNA和雙向LncRNA。在機(jī)體生長發(fā)育過程中，LncRNA的表達(dá)具有較高的組織、細(xì)胞特異性，不同類型的LncRNA可以作為信號分子、蛋白質(zhì)相互作用的支架、誘餌以及靶向轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合引導(dǎo)序列等，參與染色體修飾、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)相互作用[12]。

表2 胃癌組織中LINC00858表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis of LINC00858 expression level and clinicopathological parameters in gastric cancer patients

LncRNA在個體生長發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展中的研究相對于蛋白編碼基因的研究較晚。但隨著LncRNA功能研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)LncRNA在不同組織、細(xì)胞發(fā)育的過程中也具有重要作用[13]，已有研究顯示，LncRNA-ES1、LncRNA-ES2和Linc-ROR主要分布于多能性細(xì)胞中，與胚胎干細(xì)胞或iPS細(xì)胞多能性的維持相關(guān)；Bvht、Fendrr與心臟組織形成相關(guān)且主要存在于心臟組織中；HOTAIR和H19等LncRNA在腫瘤形成、發(fā)展過程中異常表達(dá)。在腫瘤研究中，大量研究結(jié)果顯示，LncRNA的異常表達(dá)被證實與腫瘤的生長、侵襲和遷移相關(guān)。已有研究顯示，H19、HOTAIR和MALAT1等LncRNA表達(dá)量增加與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，提高H19、HOTAIR和MALAT1的表達(dá)量能夠促進(jìn)肝癌、乳腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)相關(guān)癌癥組織的生長、侵襲和遷移，而與上述LncRNA相反，GAS5、MEG3等LncRNA在多種腫瘤組織中的表達(dá)量呈下降趨勢，提高GAS5及MEG3基因的表達(dá)量則可抑制腫瘤的生長[14]；2013年SONG等[15]通過LncRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中有135個LncRNA分子的表達(dá)與正常組織相比存在異常。胃癌組織中異常LncRNA表達(dá)能夠通過多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長變化[16-17]，如LINC00152等能通過靶基因的結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長相關(guān)信號通路的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖；HOTAIR能夠通過組蛋白H3K27乙?；揎椀恼{(diào)節(jié)促進(jìn)胃癌組織細(xì)胞由表皮向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；GAS5能夠與miR-222、miR-23a等結(jié)合抑制胃癌細(xì)胞的增殖[18-19]。在LINC00858相關(guān)研究中，已有報道顯示：LINC00858在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量升高，能夠與AC02128.2、RP11-138J23.1等共同用于結(jié)腸癌的篩選[11]，在骨肉瘤中LINC00858能夠通過miR-139-CDK14通路調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的生長[10]，而在非小細(xì)胞肺癌中LINC00858則可以競爭結(jié)合miR-422a抑制miR-422a的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的生長[9]。在本研究中，我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫中LINC00858表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，LINC00858在除腎臟相關(guān)腫瘤及骨髓癌以外的其他腫瘤組織中表達(dá)量均上調(diào)，且其表達(dá)量變化與胃癌患者的臨床分期、總生存期及無病生存期存在相關(guān)性，然而，截止目前還未見LINC00858在胃癌中的作用及作用機(jī)制相關(guān)的報道。

總之，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析及20例胃癌患者胃癌組織及癌旁組織中LINC00858表達(dá)量的檢測證實：LINC00858表達(dá)量升高與胃癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，LINC00858在胃癌組織中的表達(dá)量較癌旁組織高，胃癌患者臨床分期越晚，LINC00858表達(dá)量越高。LINC00858可能對胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有調(diào)節(jié)作用，可作為胃癌治療及預(yù)后監(jiān)測的輔助檢測指標(biāo)。