蘭 勇 邢人偉 陳 明 王旭林

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 是全球第三大常見癌癥，具有高發(fā)生率和高病死率的特點(diǎn)。肝癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，由多種因素，多個(gè)階段共同參與，目前研究較多的是Notch通路和Wnt通路[1]。研究表明，經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，而細(xì)胞的自我更新能力的失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[2]。肝癌干細(xì)胞具有干細(xì)胞的某些特性，如能夠自我更新、增殖與分化，并參與腫瘤的復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移過程，能夠產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤[3]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干細(xì)胞與肝癌患者的治療效果不佳和預(yù)后效果差具有重要關(guān)系[4]。因此研究腫瘤干細(xì)胞對肝癌的治療與預(yù)后具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3基因調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，且在肝癌組織中異常表達(dá)[5]。Tim-3能夠促進(jìn)腫瘤的分化、生長，且有助于腫瘤的遷移[6]。但關(guān)于Tim-3對肝癌干細(xì)胞的自我更新能力及對Wnt/β-catenin 信號通路影響尚未報(bào)道。因此本研究以肝癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過抑制HepG2干細(xì)胞中Tim-3基因的表達(dá)，系統(tǒng)研究Tim-3對肝癌干細(xì)胞的自我更新能力以及對Wnt/β-catenin 信號通路的影響，為腫瘤的診斷、靶向治療和預(yù)后提供新的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料與儀器：人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721，人正常肝細(xì)胞系L02為對照，細(xì)胞系購自上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Sigma公司，青霉素、鏈霉素購自華北制藥公司，Trizol試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF微孔濾膜購自美國Bio-Rad 公司，GAPDH、Tim-3抗體購自英國Abcam公司，HRP酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購自美國Jackson Immuno Research公司。UV-1601紫外分光光度計(jì)購自日本SHIMADZ公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司，熒光定量PVR儀購自德國Eppendorf公司Mastercycler nexus。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及肝癌干細(xì)胞的分離：人細(xì)胞系HepG2、SMMC7721、L02培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，懸浮細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS輕輕洗1～2次，0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化完成后用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，1000r/min離心收集細(xì)胞，接種到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2～3代，收集對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行研究。收集對數(shù)生長期的HepG2、SMMC7721、L02細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞株做3個(gè)重復(fù)，穩(wěn)定感染Lv-PNanog-GFP 慢病毒，對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液過200目篩網(wǎng)，基于Nanog啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP報(bào)告系統(tǒng)，流式細(xì)胞儀檢測GFP綠色熒光，分選GFP陽性和GFP陰性細(xì)胞，即分為Nanog陽性(+)的肝癌干細(xì)胞及Nanog陰性(-)的肝癌細(xì)胞。

3.qRT-PCR檢測細(xì)胞中mRNA的表達(dá)：收集各細(xì)胞系對數(shù)期細(xì)胞，用Trizol法抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為c DNA，熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測各細(xì)胞系Tim-3 RNA相對表達(dá)量。SYBR Green法熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因。根據(jù)NCBI相應(yīng)的序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，采用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

4.Western blot法檢測蛋白的表達(dá)：取各組作用后細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取樣本總蛋白，BCA蛋白法測定蛋白濃度，記錄562nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。SDS變性蛋白，99℃煮沸10min，分裝儲存?zhèn)溆?。SDS-PAGE凝膠電泳后將其轉(zhuǎn)于醋酸纖維素膜(PVDF)上，5%脫脂奶封閉液封閉1h；一抗4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次；二抗HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG室溫孵育2h，TBST液洗膜3次。ECL法顯影，用Image J對顯影照片中的目的條帶進(jìn)行灰度吸光度分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選擇Tim-3表達(dá)量最高的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染選用對數(shù)期細(xì)胞，融合度80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染。按照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將Tim-3 siRNA 轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，并在轉(zhuǎn)染率最高時(shí)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，并用Western blot法檢測Tim-3蛋白的表達(dá)，檢測最佳干預(yù)片段。siRNA的引物信息詳見表2。

表2 siRNA引物信息

6.細(xì)胞克隆形成能力的檢測：取對數(shù)期HepG2細(xì)胞和經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染敲除Tim-3的HepG2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，50個(gè)/孔接種于24孔板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，于10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每3～4天更換新鮮培養(yǎng)液，定期觀察細(xì)胞，出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)進(jìn)行染色。PBS漂洗2遍，甲醇固定10min，加入1%結(jié)晶紫溶液染色30min，清水沖洗染色液，風(fēng)干，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)數(shù)一般以50個(gè)細(xì)胞以上的克隆團(tuán)為1個(gè)陽性克隆，平均克隆形成率(%)=(平均克隆形成個(gè)數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

7.細(xì)胞成球生長能力的檢測：取對數(shù)期HepG2細(xì)胞和經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染敲除Tim-3的HepG2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞成球試驗(yàn)，按10個(gè)/孔接種于低黏附的96孔板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，于加入20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、10ng/ml HGF、20μl/ml B27及適量抗生素的DMEM/F12成球培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天補(bǔ)加1次新鮮培養(yǎng)液，10～14天后在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)每孔中直徑>75μm的細(xì)胞球，成球率(%)=(平均細(xì)胞球數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100% 。

結(jié) 果

1.qRT-PCR檢測3個(gè)細(xì)胞系中Tim-3 mRNA水平的表達(dá)：qRT-PCR檢測L02、SMMC7721、HepG2 3個(gè)細(xì)胞系中Tim-3 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，L02、SMMC7721、HepG2細(xì)胞株Tim-3的表達(dá)水平分別為1.020±0.102、1.510±0.254、3.160±0.312。Tim-3在肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721中的 mRNA表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞L02(P<0.05),詳見圖1。

圖1 3組細(xì)胞Tim-3 mRNA表達(dá)水平的比較

2.qRT-PCR檢測肝癌干細(xì)胞中Tim-3 mRNA水平的表達(dá)：將穩(wěn)定感染Lv-PNanog-GFP 慢病毒的肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7721經(jīng)流式細(xì)胞儀分為Nanog(+)和Nanog(-)細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測兩類細(xì)胞中Tim-3 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Tim-3在HepG2細(xì)胞系Nanog(+)的表達(dá)明顯高于Nanog(-)(P<0.05)；在SMMC7721細(xì)胞系Nanog(+)與Nanog(-)比較Tim-3 mRNA表達(dá)有降低趨勢,詳見圖2。

圖2 3組細(xì)胞Tim-3 mRNA表達(dá)水平的比較*P<0.05

3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的檢測：根據(jù)qRT-PCR檢測Tim-3表達(dá)較高的HepG2細(xì)胞進(jìn)行Tim-3 siRNA轉(zhuǎn)染，選擇轉(zhuǎn)染后的最佳作用時(shí)間為24h，經(jīng)熒光鏡和光學(xué)顯微鏡對比觀察細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%，詳見圖3。

4.篩選轉(zhuǎn)染效率較高的siRNA片段：Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組Tim-3的蛋白表達(dá)水平，Tim-3蛋白表達(dá)在HepG2與siRNA-NC無顯著差異，Tim-3蛋白在siRNA-451組細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于siRNA-750、siRNA-NC、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)，通過轉(zhuǎn)染siRNA-451成功沉默了Tim-3蛋白的表達(dá)，下調(diào)效果良好，可選擇該組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，詳見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA的HepG2顯微圖(×200)A.白光；B.熒光

圖4 Western blot法檢測各轉(zhuǎn)染組Tim-3的蛋白表達(dá)

5.轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞Tim-3、Wnt3、β-catenin 的蛋白表達(dá)水平：沉默Tim-3基因之前，肝癌干細(xì)胞中Tim-3 蛋白高表達(dá)，同時(shí)Wnt3和β-catenin 蛋白也高表達(dá)，表明Tim-3與Wnt信號通路存在一定關(guān)系。在沉默HepG2肝癌干細(xì)胞Tim-3基因后，Tim-3蛋白表達(dá)下降，Wnt信號通路中Wnt3 和 β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著下降，詳見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后Tim-3、Wnt3、β-catenin 的mRNA表達(dá)水平

6.肝癌干細(xì)胞自我更新能力的變化：克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)檢測Nanog(+)肝癌干細(xì)胞在Tim-3基因敲除前后自我更新能力的變化。檢測結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞系HepG2的Nanog(+)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA后，細(xì)胞的克隆形成能力和細(xì)胞球生長能力均顯著降低(P<0.05，圖6、圖7)。

圖6 轉(zhuǎn)染Tim-3后干細(xì)胞克隆形成能力

圖7 轉(zhuǎn)染Tim-3后干細(xì)胞成球能力

討 論

肝癌多數(shù)為原發(fā)性肝癌，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞或者膽管細(xì)胞癌，90%以上為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。肝癌在全球范圍內(nèi)發(fā)生率均較高，45～60歲中老年人發(fā)生率顯著升高。目前對于肝癌的治療方法主要是手術(shù)切除、介入治療、肝移植、靶向治療、放射治療、化學(xué)治療等，但根治性手術(shù)治療的概率僅有10%～15%，因?yàn)楦伟┩l(fā)現(xiàn)在晚期診斷，已錯(cuò)過最佳手術(shù)治療時(shí)間，且手術(shù)后患者的預(yù)后生存率較低[7]。腫瘤通常以形態(tài)和功能的異質(zhì)性增殖為特征，研究認(rèn)為腫瘤中有一小部分細(xì)胞是特征性腫瘤干細(xì)胞或起源細(xì)胞，其能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[8]。腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化的能力與正常的干細(xì)胞相似[9]。2003年首次從乳腺癌實(shí)體腫瘤中分離出腫瘤干細(xì)胞，這些細(xì)胞表現(xiàn)類似于腫瘤的異種移植物，且可以在小鼠體內(nèi)連續(xù)產(chǎn)生腫瘤，表明這些干細(xì)胞具有自我更新能力[10]。因此研究肝癌干細(xì)胞對肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制具有重要作用。

Tim-3是Tim基因家族的一員，是一種參與免疫應(yīng)答的Th1細(xì)胞表面相關(guān)的因子，并且與腫瘤的形成、生長、轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系。Tim-3不僅在成熟的TH1細(xì)胞表達(dá)，在單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、TH17、CD8+T、腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3對抗病毒T細(xì)胞的應(yīng)答起到調(diào)節(jié)作用，Tim-3與抑制性分子結(jié)合后可以減輕T細(xì)胞的衰老和死亡來增強(qiáng)T細(xì)胞免疫[11]。研究報(bào)道，Tim-3在淋巴瘤中高表達(dá)，并通過介導(dǎo)免疫逃逸促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[12]。Tim-3在胃癌、肝癌中的表達(dá)顯著高于正常組織，與疾病進(jìn)程密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是Tim-3的配體，Tim-3/Galectin-9可以下調(diào)Th1細(xì)胞的免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的死亡[13]。

Klibi研究表明，鼻咽癌細(xì)胞中，阻斷Tim-3與Galectin-9的結(jié)合，可以減輕鼻咽癌對Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)[14]。Wiener等[15]研究表明，Tim-3可以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的表達(dá)，表明抑制Tim-3基因可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的表達(dá)。因此抑制Tim-3基因的表達(dá)，可以減弱其對腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用，加強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，控制腫瘤細(xì)胞的自我更新能力。本研究檢測了兩個(gè)肝癌細(xì)胞系SMMC7721、HepG2與正常肝細(xì)胞系L02的Tim-3表達(dá)水平，結(jié)果顯示SMMC7721、HepG2中Tim-3的表達(dá)顯著高于L02，與上述結(jié)果一致。本研究中，轉(zhuǎn)染siRNA后Tim-3基因表達(dá)顯著降低，其與Galectin-9結(jié)合減弱，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用減弱。

目前研究較多的肝臟腫瘤的分子機(jī)制是Wnt信號通路。Wnt信號通路調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育并決定細(xì)胞的分化[16]。Wnt家族由19個(gè)糖蛋白組成，參與復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。研究表明，經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，而細(xì)胞的自我更新能力的失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[17]。機(jī)體正常情況下，β-catenin與胞質(zhì)中APC、Axin、CKI、GSK-3β等結(jié)合相互作用，后被蛋白酶體降解[18]。Wnt/β-catenin 信號通路激活時(shí)，Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合，復(fù)合體中GSK-3β失去活性，導(dǎo)致 β-catenin不能被磷酸化降解，β-catenin 與復(fù)合體分離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與TEF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活靶基因[19]。何艷嬌等[20]研究發(fā)現(xiàn)β-catenin的異常表達(dá)在乳腺癌中具有重要作用，且β-catenin與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年來研究表明，Wnt信號通路與干細(xì)胞的分化相關(guān)，其在造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、腸道干細(xì)胞等多種干細(xì)胞中維持干細(xì)胞增殖并抑制其分化[21]。Sato等[22]研究報(bào)道，Wnt通路目的基因表達(dá)上調(diào)可提高人胚胎干細(xì)胞的自我更新能力。Kruger等[23]研究結(jié)果表明，小鼠乳腺癌細(xì)胞的Wnt和轉(zhuǎn)化因子-β2表達(dá)均升高，進(jìn)一步表明Wnt信號通路促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，抑制其分化為其他細(xì)胞。

為了探討Tim-3與肝癌干細(xì)胞的關(guān)系，本研究檢測了Tim-3在腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Tim-3在肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于肝癌細(xì)胞，表明Tim-3可能與干細(xì)胞特性相關(guān)。通過比較下調(diào)Tim-3后細(xì)胞的自我更新能力發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Tim-3后細(xì)胞的克隆形成能力及細(xì)胞成球能力均顯著下降，表明下調(diào)Tim-3抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，這表明Tim-3在肝癌干細(xì)胞的自我更新維持中具有重要作用。本研究中抑制Tim-3基因表達(dá)后，Wnt3及β-catenin 表達(dá)水平也顯著降低，表明Tim-3調(diào)控Wnt3及β-catenin的表達(dá)，其表達(dá)降低可以引起Wnt信號通路減弱，影響腫瘤細(xì)胞的激活。

綜上所述，抑制Tim-3的表達(dá)能夠拮抗Tim-3對肝癌細(xì)胞的免疫抑制作用，下調(diào)Wnt信號通路的激活及肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，本研究尚存在不足之處，對其具體作用機(jī)制尚未研究清楚。