王慧琴 王 瑤 趙宗峰 吳衛(wèi)東

銀屑病(psoriasis)是一種常見(jiàn)的慢性炎性皮膚病，以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生和角化不全為主要病理改變的。目前銀屑病無(wú)法根治，并且具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中微小核糖核酸即miRNA起到了重要作用[1～3]。本研究選擇miR-34a及其靶蛋白Fxop1為研究對(duì)象，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-34a在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)水平；在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物和抑制劑由此來(lái)研究下游靶蛋白Foxp1的表達(dá)是否受其調(diào)控；具體分析如下。

材料與方法

1.材料：尋常型銀屑病皮損組織選自2012～2016年在筆者醫(yī)院皮膚科就診并確診的患者12例，其中男性5例，女性7例，患者年齡19～71歲，平均年齡44.417±17.547歲；取材前未使用過(guò)相關(guān)藥物及治療；不伴有其他免疫和腫瘤疾??；排除妊娠、哺乳期等女性；以此為病例組。正常皮膚組織取自泌尿外科、整形外科、截肢者手術(shù)切除的皮膚共12例，其中男性6例，女性6例；患者年齡7～60歲，平均年齡27.500±24.333歲,以此為正常對(duì)照組，正常對(duì)照組需排除自身免疫性疾病、遺傳性疾病，并無(wú)銀屑病家族史。本研究獲筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2.核酸提?。喝龃娼M織30～50mg，迅速置于研缽，倒入液氮研磨，然后根據(jù)miRNeasy Mini kit(德國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行核酸提取。提取的樣本總RNA用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)測(cè)定其濃度及純度，A260/A280比值在1.8～2.2，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.反轉(zhuǎn)錄：使用miScript Ⅱ RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，包含4種試劑5×HIFlex Buffer，10×Nucleics Mix，RT Enzyme Mix，RNase-Free H2O2；反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)在Bio-Rad C1000 Touch PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行。反應(yīng)體系：5×HIFlex Buffer 4μl，10×Nucleics Mix 2μl，RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA+ RNase-Free H2O2共 12μl。將加好試劑的EP管放置于C1000 Touch PCR儀反應(yīng)槽中，設(shè)置反應(yīng)條件：37℃ 60min，95℃ 5min。收集反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用miScript SYBR?Green PCR kit 試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，包含Quantitect SYBR Green PCR Master Mix和RNase-Free H2O2兩種試劑；反應(yīng)體系為20μl：2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10×miR-34a特異性引物 2μl，10×U6 2μl，RNase-Free H2O25μl，模板 1μl。miR-34a特異性引物及U6均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司成品。反應(yīng)在Rotor Gene-Q儀(德國(guó) Qiagen公司)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃ 15min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后用Rotor-Gene Q Series Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)出和分析，得出曲線及Ct值。

5.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞(江蘇南京凱基生物技術(shù)公司)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，加入10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，同時(shí)添加雙抗(美國(guó)Sigma公司)?；瘜W(xué)合成成品miR-34a mimic(德國(guó)Qiagen公司)和miR-34a inhibitor(德國(guó)Qiagen公司)，用Lipofectamine2000試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%；稀釋miRNA，稀釋lipo2000輕輕混勻并室溫孵育20min；將miRNA-lipo2000 混合液加入含有細(xì)胞的500μl 培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；培養(yǎng)4～6h后，將孔中含siRNA-lipo2000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

6.Western blot(WB)法檢測(cè)Foxp1表達(dá)：轉(zhuǎn)染成功后收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳；蛋白樣本電泳分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%蛋白質(zhì)干粉TBST封閉1h；TBST洗膜10min 3次，加Foxp1一抗(英國(guó)Abcam公司)1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，稀釋二抗1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，暗室曝光定影。WB實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑除一抗外均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

結(jié) 果

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR以U6擴(kuò)增作為參照， miR-34a擴(kuò)增良好(圖1、圖2)。病例組miR-34a的表達(dá)高于正常對(duì)照組，即尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-34a呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.047，P=0.011，表1)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a的擴(kuò)增曲線圖

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a的溶解曲線圖

組別nmiR-34atP正常對(duì)照組120.0067±0.00213.0470.011病例組120.0243±0.0199*

與正常組織比較,*P<0.05

2.Western blot法檢測(cè)結(jié)果:培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染分為3個(gè)組，即正常對(duì)照組、miR-34a過(guò)表達(dá)組、miR-34a 抑制表達(dá)組。Western blot法檢測(cè)3組Foxp1蛋白表達(dá)結(jié)果：miR-34a過(guò)表達(dá)組Foxp1蛋白表達(dá)量高；miR-34a抑制表達(dá)組Foxp1蛋白表達(dá)量低；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.722，P=0.000)。LSD法組間比較顯示,與正常對(duì)照組比較，miR-34a抑制表達(dá)時(shí)Foxp1蛋白表達(dá)降低(P=0.002)；與正常對(duì)照組比較，miR-34a過(guò)表達(dá)時(shí)Foxp1蛋白表達(dá)量增加(P=0.000)；miR-34a過(guò)表達(dá)組與miR-34a抑制表達(dá)組Foxp1蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，表2、圖3)。

表2 miR-34a轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不同組中Foxp1蛋白Western blot法檢測(cè)表達(dá)量

圖3 不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染組中Foxp1蛋白表達(dá)水平圖

討 論

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種多基因遺傳背景下受多因素調(diào)控的慢性炎性疾病。有研究表明,miRNA與皮膚生理、生化、免疫等許多過(guò)程均有重要相關(guān)性[2～5]。miR-34a定位于人類1p36染色體上，共有110個(gè)核甘酸序列，單獨(dú)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)miR-34參與了Cyclin/CDK-pRb 途徑，通過(guò)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染能夠引起G1期細(xì)胞周期停滯，并且miR-34與細(xì)胞周期密切相關(guān)[7]，miR-34在癌細(xì)胞中重新激活可誘發(fā)caspase調(diào)控的凋亡途徑[8]。此外，miR-34也可能與其他miRNA發(fā)揮協(xié)同作用，Bandi等發(fā)現(xiàn)miR-34a與miR-15/16共同作用誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，而且miR-34a及miR-15/16在腫瘤中均低表達(dá)[9]。miR-34a可通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因而參與細(xì)胞增殖、凋亡、存活、遷移、侵襲以及血管生成等生物過(guò)程[7,10]。因此本研究選擇miR-34a為切入點(diǎn)，檢測(cè)其在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)；并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行離體研究，觀察靶蛋白Foxp1量的變化，綜合多種方法來(lái)探究二者與銀屑病發(fā)病可能的關(guān)系。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明：miR-34a在尋常型銀屑病皮損組織中呈高表達(dá)，其與正常健康皮膚組織的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.047，P<0.05)。禹歡歡等[1]、陳春麗等[4]、楊志波等[11]利用不同技術(shù)方法得出miR-34a在銀屑病中表達(dá)明顯上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。筆者推測(cè)miR-34a異常表達(dá)促使表皮角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡加速，過(guò)度增殖；細(xì)胞周期的變化使病理改變推進(jìn)，因此miR-34a參與了尋常型銀屑病發(fā)病過(guò)程。

叉頭框蛋白p1(forkhead box P1，F(xiàn)OXP1)是miR-34a的重要靶基因，位于染色體3p14.1，完整編碼產(chǎn)物含677個(gè)氨基酸的蛋白，在人類組織上有廣泛的、程度不同的表達(dá)[12～14]。叉頭框蛋白P1(Foxpl)基因隸屬于FOX(forkhead box)家族的P亞族。FOX家族是一個(gè)龐大的、功能廣泛并且進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，其特點(diǎn)是具有叉頭螺旋結(jié)構(gòu)(forkhead/winged helix,FKH)[13～15]。FOX家族蛋白參與了如胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，其突變和表達(dá)異?？蓪?dǎo)致發(fā)育畸形、代謝紊亂以及腫瘤的發(fā)生等疾病[11～18]。Foxp1受miR-34a調(diào)控參與多種生物學(xué)過(guò)程，并與皮膚性疾病的生理、免疫等密切相關(guān)。有研究表明在皮膚基底細(xì)胞癌中FOXP1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織[19]。陳春麗等[16]利用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)Foxp1蛋白表達(dá)在正常皮膚組織中的陽(yáng)性率低于尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)，且陽(yáng)性主要于表皮全層細(xì)胞核表達(dá)。這與筆者轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞的研究結(jié)果一致：培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞并轉(zhuǎn)染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，miR-34a過(guò)表達(dá)時(shí)Foxp1蛋白表達(dá)量增加；miR-34a抑制表達(dá)時(shí)Foxp1蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.722,P<0.01)。

綜上所述，筆者推斷在尋常型銀屑病發(fā)病過(guò)程中高表達(dá)的miR-34a通過(guò)調(diào)控其靶蛋白Foxp1參與了表皮細(xì)胞的異常增殖過(guò)程。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生的過(guò)程說(shuō)明細(xì)胞周期被打亂，細(xì)胞凋亡加速，免疫調(diào)節(jié)紊亂，由此認(rèn)為miR-34a及其靶蛋白Foxp1與尋常型銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)。