亢奮恒 張博文 戴大鵬 李傳寶 蔡劍平

研究報(bào)道稱細(xì)胞色素P2C9(CYP2C9)是人類最重要的藥物代謝酶。細(xì)胞色素P2C9是P450酶家族中的重要成員，是肝微粒體中一種十分重要的藥物代謝酶，催化10%～20%臨床常用藥物在肝內(nèi)的代謝[1,2]。大量研究表明，細(xì)胞色素P2C9具有眾多等位基因，大部分突變體蛋白的活性呈現(xiàn)明顯下降，是引起某些藥物代謝能力個體差異的重要原因[3,4]。

在1例常年口服低劑量(1.5～2.0mg/d)華法林患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種的新的細(xì)胞色素P450 2C9變異型，在1號外顯子32位發(fā)生了T>C突變，引起Leu11>Pro11的氨基酸改變。為探究其催化能力是否發(fā)生明顯改變，本研究引入甲苯磺丁脲作為探針?biāo)?。根?jù)以往研究，作為其重要代謝底物之一的甲苯磺丁脲，在人體內(nèi)代謝途徑單一，幾乎均由肝細(xì)胞色素P2C9催化代謝，是絕大多數(shù)細(xì)胞色素P2C9研究者必選的探針?biāo)嶽5,6]。

現(xiàn)有研究表明，中國人群中最常見的細(xì)胞色素P2C9缺陷型突變體為細(xì)胞色素P2C9*3和*13，其中以*3最為多見，故本研究引入野生型* 1和突變型* 3 作為參照，通過對比3種細(xì)胞色素P2C9對底物藥甲苯磺丁脲的催化速率，以期指導(dǎo)該等位基因攜帶者的個體化用藥。

材料與方法

1.材料：(1)主要試劑：Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；DH10 Bac化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(美國 Invitrogen公司)；Spodoptera frugiperda昆蟲細(xì)胞，Sf-900TMⅢSFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清及Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(美國Invitrogen公司)，Prime STAR MAX DNA聚合酶、DNA連接試劑盒(日本TaKaRa公司)，商業(yè)化CYP2C9微粒體及細(xì)胞色素b5微粒體(美國BD Gentest公司)，兔抗人CYP2C9多克隆抗體(英國AbD serotec公司)，小鼠抗人OR單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)，蛋白定量及ECL顯色kit(美國Pierce公司)，甲苯磺丁脲(美國Sigma公司)，4-Hydroxytolbutamide(加拿大Toronto Research Chemicals公司)，NADPH生成系統(tǒng)(北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，HPLC級溶劑(美國Fisher Scientific公司)，其余常規(guī)試劑均為優(yōu)級純或分析純。(2)主要儀器：冷凍離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)(日本Kubota公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、細(xì)胞超聲破碎儀(美國 Sonic公司)，電泳儀及水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)、Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，所用常規(guī)耗材均購自美國Axygen公司。

2.CYP2C9基因定點(diǎn)誘變和ORF區(qū)擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI公布的CYP2C9全基因組序列(NM 000771.3)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)開放閱讀框(ORF)區(qū)擴(kuò)增引物、突變位點(diǎn)相應(yīng)的上下游寡核苷酸引物(分別命名為-2F和-1R)以及測序引物(表1)，引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。

3.pFastBac-dual-OR-2C9雙表達(dá)載體的構(gòu)建：將美國Origen公司購買的細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CYPOR)的ORF區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，回收之后進(jìn)行XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切，再將產(chǎn)物與同樣雙酶切的空載體 pFastBac-dual連接，即獲得可接收 CYP2C9 擴(kuò)增產(chǎn)物的中間載體pFastBac-dual-OR。利用重疊延伸PCR技術(shù)，以細(xì)胞色素P2C9*1質(zhì)粒為模板，獲得細(xì)胞色素P2C9*3、細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的cDNA全長[7,8]。將細(xì)胞色素P2C9的cDNA區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行EcoRΙ/SalΙ雙酶切，與同樣酶切的中間載體pFastbac-dual-OR(含CYPOR的結(jié)構(gòu)基因)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后用PCR法篩選陽性克隆，挑取陽性克隆隔夜搖菌，提取質(zhì)粒后送北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行序列測定，以確認(rèn)所獲載體中定點(diǎn)誘變位點(diǎn)堿基與設(shè)計(jì)完全一致。

表1 構(gòu)建CYP2C9重組質(zhì)粒載體的引物

下劃線處序列為限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，下劃線處堿基為突變位點(diǎn)；CYP2C9(32T>C)突變位點(diǎn)為1號外顯子第32位，CYP2C9*3突變位點(diǎn)為7號外顯子第1075位

4.桿粒載體Bacmid-OR-CYP2C9s的制備及PCR驗(yàn)證：陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10bac感受態(tài)細(xì)胞以后，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆隔夜搖菌，利用桿狀病毒穿梭載體bacmid抽提試劑盒提取重組桿粒DNA，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證所用引物如下(表2)。

表2 對重組桿粒載體進(jìn)行PCR驗(yàn)證的正向和反向引物

5.桿狀病毒的獲得和增殖：參照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System試劑盒使用說明，包裝Bacmid-OR-CYP2C9昆蟲病毒，所獲病毒侵染偽黏蟲卵巢細(xì)胞，觀察細(xì)胞在不同生長階段的特征(表3)，在轉(zhuǎn)染后期階段收集P1代病毒，利用獲得的P1代病毒繼續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)生P2代病毒。

表3 病毒侵染后的偽黏蟲卵巢細(xì)胞不同生長階段顯微鏡下特征

6.高表達(dá)細(xì)胞色素P2C9昆蟲微粒體的獲得：將P2代病毒上清繼續(xù)培養(yǎng)，72h后離心收集細(xì)胞，洗滌后重懸于5ml重懸液(0.25mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA，0.5mmol/L PMSF)中，利用超聲破碎儀進(jìn)行破碎，破碎產(chǎn)物經(jīng)12000g 離心后去除細(xì)胞碎片，將得到的上清經(jīng)100000g超速離心，再將得到的沉淀物(微粒體)重懸于微粒體儲存液中，凍存于-80℃冰箱。

7.使用免疫印跡法對重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行鑒定：用BCA法測定微粒體蛋白濃度，取5μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉，封閉后進(jìn)行一抗孵育(一抗選擇兔抗人CYP2C9抗體和鼠抗人CYPOR抗體)，4℃條件下孵育過夜，次日將PVDF膜取出洗滌后進(jìn)行二抗孵育(二抗選擇山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG)，滴加曝光液后用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

8.LCMS/MS檢測細(xì)胞色素P2C9對甲苯磺丁脲的代謝：(1)催化體系：由重組細(xì)胞色素P2C9蛋白、細(xì)胞色素b5、NADPH輔酶、Tris-HCl以及甲苯磺丁脲組成200μl反應(yīng)體系。(2)催化過程：37℃孵育1h后，加入氯磺丙脲和HCl，置于渦旋震蕩器震蕩 2min，加入冰乙酸乙酯繼續(xù)渦旋震蕩2min，離心后轉(zhuǎn)移有機(jī)層，用氮吹儀吹干，加入100μl流動相復(fù)溶并取20μl于Agilent 1200高效液相色譜儀檢測。(3)色譜檢測條件：色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18柱(4.6mm×150.0mm，5μm，美國Agilent公司)，流動相為0.05%TFA∶乙腈=70∶30，流速為0.4ml/min，柱溫40℃，上樣體積為2μl，內(nèi)標(biāo)為氯磺丙脲。(4)最大反應(yīng)速度Vm及米氏常數(shù)Km值的計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將代謝產(chǎn)物4-Hydroxytolbutamide定量后，利用Prism軟件(version 5，美國GraphPad公司)計(jì)算Vm、Km值以及清除率(Vm/Km)。

結(jié) 果

1.對新細(xì)胞色素P2C9突變體重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證：以CYP2C9-EF和CYP2C9-SR為引物，將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)公司測序，測序結(jié)果用Oligo7軟件進(jìn)行序列分析，箭頭所指處顯示，堿基T→C誘變成功(圖1)。

圖1 細(xì)胞色素P2C9新突變型重組質(zhì)粒測序結(jié)果

2.利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對重組質(zhì)粒載體進(jìn)行鑒定：將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，大小約1500bp(圖2)。

圖2 重組細(xì)胞色素P2C9質(zhì)粒載體PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.使用免疫印跡法對重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行定性檢測：免疫印跡結(jié)果顯示，在同一張PVDF膜55000與78000左右出現(xiàn)以下兩個條帶(圖3)，與目標(biāo)蛋白相對分子質(zhì)量接近，箭頭以上條帶為細(xì)胞色素P2C9(相對分子質(zhì)量約為53000～55000)，箭頭以下條帶為細(xì)胞色素P450氧化還原酶(相對分子質(zhì)量約為78000)。

圖3 免疫印跡法檢測重組細(xì)胞色素P2C9微粒體蛋白STD.購自美國BD Gentest公司的CYPC29標(biāo)準(zhǔn)品;OR.只表達(dá)細(xì)胞色素P450氧化還原酶的陰性對照

4.使用免疫印跡法對重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行定量檢測：將美國BD Gentest公司購買的細(xì)胞色素P2C9*1微粒體標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為2.4、1.2、0.6和0.3pmol/μl 4種不同濃度(圖4)，利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析后，經(jīng)對比定量計(jì)算，重組微粒體細(xì)胞色素P2C9*1、重組細(xì)胞色素P2C9*3、重組細(xì)胞色素P2C9(32T>C)濃度分別為：2.256、2.103、2.434pmol/μl。

圖4 免疫印跡法對重組細(xì)胞色素P2C9進(jìn)行定量檢測S1～S4分別為2.4、1.2、0.6、0.3pmol/μl 4種不同濃度的CYP2C9標(biāo)準(zhǔn)品

5.細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的催化活性：體外代謝檢測結(jié)果表明，細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對于甲苯磺丁脲的清除率為野生型*1的12.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的清除率明顯低于野生型，接近典型突變型*3(圖5)。

表4 細(xì)胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲代謝的酶動力學(xué)參數(shù)

與CYP2C9*1比較，*P<0.05

圖5 細(xì)胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲的酶促動力學(xué)曲線圖

討 論

作為人體肝臟中一種非常重要的藥物代謝酶，細(xì)胞色素P2C9不僅含量豐富(約占細(xì)胞色素P450總量的20%)，而且可以催化眾多不同類型藥物的代謝[9～12]。從中選擇哪些藥物作為研究的底物藥，是首先要考慮的問題。雖然該突變型是從1例華法林慢代謝型患者身上發(fā)現(xiàn)的，但由于人體對華法林的代謝受多種因素影響，除了細(xì)胞色素P2C9以外，VKORC1的基因多態(tài)性也具有重要影響[13,14]。本研究僅對攜帶者CYP2C9基因編碼區(qū)的9個外顯子進(jìn)行測序，并不知道VKORC1等基因的變異情況。因此，單獨(dú)研究細(xì)胞色素P2C9對華法林的代謝功能，對于患者個體化用藥的指導(dǎo)意義并不是很大。相比之下，甲苯磺丁脲在人體內(nèi)代謝途徑單一，80%以上在肝內(nèi)被細(xì)胞色素P2C9羥化代謝，是體外研究細(xì)胞色素P2C9活性的絕佳底物藥[15]。

與其他細(xì)胞色素P450家族比較，細(xì)胞色素P2C9的等位基因在人群中存在高度的遺傳多態(tài)性，目前已被統(tǒng)計(jì)命名的有60種，其中最常見的突變型是*2和*3，它們和野生型細(xì)胞色素P2C9*1是目前研究最多的3種型別[16～19]。中國人群中最常見的突變類型是*3與*13，其中以*3最為多見，故本項(xiàng)研究選擇了我國人群中最多見的細(xì)胞色素P2C9基因型*1和*3作為參照，通過對比對細(xì)胞色素P2C9(32T>C)新突變型的催化功能作出評價(jià)。

Western blot法檢測結(jié)果表明，細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的蛋白表達(dá)量與野生型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該變異基因并未影響蛋白質(zhì)的正常表達(dá)。體外藥物代謝檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞色素P2C9*3的清除率為9.09%，與以往研究結(jié)果相似，說明在同等條件下測得的細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的催化活性具有一定的可信度。細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對于探針?biāo)幬锛妆交嵌‰宓捏w外清除率為細(xì)胞色素P2C9野生型的12.40%，略高于細(xì)胞色素P2C9*3(表4)。酶促反應(yīng)曲線顯示細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對甲苯磺丁脲的催化能力接近于典型突變型細(xì)胞色素P2C9*3，酶學(xué)活性明顯下降，提示攜帶該基因型的患者服用經(jīng)由細(xì)胞色素P2C9代謝的藥物時，體內(nèi)藥物代謝速率可能會發(fā)生不同程度的降低，用藥時忽視這一點(diǎn)可能會造成藥物在體內(nèi)蓄積，引發(fā)不良反應(yīng)甚至毒性反應(yīng)(圖5)。

以往研究表明，細(xì)胞色素P2C9的催化作用具有底物依賴性，即對不同底物呈現(xiàn)出不同程度的活性改變，提示細(xì)胞色素P2C9(32T>C)在催化其他種類藥物代謝時可能會表現(xiàn)出不同的活性。本項(xiàng)研究選用細(xì)胞色素P2C9的特異性探針?biāo)幖妆交嵌‰遄鳛闄z測活性的底物藥，雖然對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)作用，但仍然有必要開展大量體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步全面研究該突變型的催化功能。