陳 堅，王 棣，向小俐，周 讓

（1.敘永縣人民醫(yī)院檢驗科，四川 敘永646400；2.重慶合川區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶401520）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%［1］。NSCLC患者的5年生存率僅為11%～15%［2］。約有75%的NSCLC患者在確診時已處于中晚期，這是引起患者預后較差的主要原因［3-5］。目前，臨床診斷NSCLC的指標主要是細胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），但兩者的靈敏度分別為60%～70%和50%～65%，特異性分別為65%～85%和60%～75%［6-8］，仍然不能滿足臨床需求。

胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是與DNA合成、細胞增殖密切相關的酶，在多種腫瘤中均有異常表達，被證實與NSCLC預后明顯相關［9］；細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）可誘導細胞基質金屬蛋白酶類的產生，促進腫瘤細胞的侵襲遷移，在NSCLC組織中，其表達有增高趨勢［10］；血管內皮細胞生 長 因 子 （vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是誘導腫瘤組織新生血管形成的關鍵因子，與腫瘤的營養(yǎng)供應及生長過程密切相關，已被證實參與了NSCLC的發(fā)?。?1］。上述三項指標可分別從細胞增殖、侵襲、營養(yǎng)供應等三個方面反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且都被證實與NSCLC的發(fā)病有關。我們推測聯(lián)合檢測上述三項指標對NSCLC的診斷及發(fā)病風險預測具有重要價值，而目前尚無上述三項指標聯(lián)合應用于NSCLC的相關報道。本研究旨在探究聯(lián)合檢測血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA對NSCLC診斷與發(fā)病風險評估中的潛在價值。

材料和方法

1 研究對象

收集2016年5月至2018年4月期間在我院經病理確診的NSCLC患者120例作為病例組，包括Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者43例。其中男性72例，女性48例；平均年齡51.3±5.1歲；平均體質指數(shù)（body mass index，BMI）為24.2±1.9 kg／m2；吸煙者57例；飲酒者34例。120例患者中鱗狀細胞癌78例，腺癌26例，大細胞癌16例。NSCLC診斷標準參照NSCLC診斷指南［12］。肺癌的分期參照國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）第七版肺癌TNM分期標準［13］，其分型依據來自于病理檢查結果。同期選取我院收治的患有肺部良性疾病患者120例作為對照組（支氣管擴張60例、錯構瘤20例、支氣管囊腫17例、纖維瘤10例、真菌性肺炎7例和其他良性疾病6例）。其中男性69例，女性51例；平均年齡50.8±4.7歲；平均體質指數(shù)為24.1±1.7 kg／m2；吸煙者60例；飲酒者30例。病例組和對照組在年齡、性別、吸煙史、飲酒史、BMI等的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究對象排除標準：①已在外院接受手術、放化療或免疫治療者；②患有其他惡性腫瘤、嚴重的心腦血管疾病及自身免疫性疾病等；③患者或其家屬不愿意簽署知情同意書者。本研究的開展經醫(yī)院倫理委員會批準。

2 臨床樣本采集與檢測方法

受試者禁食10 h以上，次日清晨由專業(yè)醫(yī)護人員使用含促凝劑采血管抽取靜脈血10mL，血液標本在1 h內于4℃條件下以12000 g離心力離心15min，收集上層血清進行相關指標檢測。TK1采用ECL印跡免疫增強發(fā)光法檢測，試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，檢測儀器為全自動化學發(fā)光圖像分析儀Tanon 4200（上海天能科技有限公司）；CYFRA21-1和CEA檢測采用化學發(fā)光法，試劑盒購于武漢博士德生物工程公司，檢測儀器為AU5800全自動生化儀（美國貝克曼庫爾特公司）；CD147與VEGF均采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，試劑盒購買于武漢默沙克生物科技有限公司，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，簡明步驟如下：所有標本經稀釋（1∶100）后依次加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min（同時加入CD147濃度為10、5、0.5 ng／L的3個標準品、陽性和陰性對照；VEGF濃度為200、20、2pg／mL的3個標準品、陽性和陰性對照），洗板5次，在避光條件下加入酶標記的單抗室溫孵育40min，再洗板5次，加入底物反應15 min后終止反應，于Nanodrop ND2000分析儀（美國賽默飛世爾公司）上檢測吸光值（A）。

3 統(tǒng)計學處理

本研究應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對于正態(tài)分布的數(shù)據，以均值±標準差（）表示。正態(tài)分布檢驗采用Shapiro-Wilktest法。正態(tài)分布數(shù)據兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較時采用單因素方差分析。率的比較采用卡方檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分 析 計 算 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA判別NSCLC的能力。Logistic回歸分析計算血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA對NSCLC的風險預測。本次統(tǒng)計分析選擇的檢驗水準為 α＝0.05。

結 果

1 研究對象的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平

研究對象血清TK1（Shapiro-Wilktest值為0.852，P＝0.641）、CD147（Shapiro-Wilktest值為0.629，P＝0.538）、VEGF（Shapiro-Wilktest值 為0.732，P＝0.616）、CYFRA21-1（Shapiro-Wilktest值為0.950，P＝0.835）和CEA（Shapiro-Wilktest值 為0.772，P＝0.694）水平符合正態(tài)分布。與對照組相比，病例組的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平顯著增高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 120例NSCLC患者與120例肺部良性疾病患者血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平的比較

2 血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平與NSCLC患者臨床特征的關系

如表2、表3所示，血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平與NSCLC患者年齡、BMI、吸煙與否、飲酒與否、性別、病理分型等無顯著關系（P＞0.05），而血清TK1、CD147和VEGF水平與腫瘤淋巴結轉移及TNM分期顯著相關（P＜0.05）。血清TK1、CD147和VEGF水平在發(fā)生淋巴結轉移或Ⅲ～Ⅳ期患者中顯著高于未發(fā)生淋巴結轉移或Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。

表2 血清TK1、CD147和VEGF水平與NSCLC患者臨床特征的關系

（續(xù)表2）

表3 血清CYFRA21-1和CEA水平與NSCLC患者臨床特征的關系

3 ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA區(qū)分NSCLC與肺部良性疾病患者的AUC分別為：0.931（95%CI：0.877～0.984，P＜0.001）、0.902（95%CI：0.842～0.965，P＜0.001）、0.785（95%CI：0.701～0.872，P＜0.001）、0.685（95%CI：0.590～0.773，P＜0.001）和0.517（95%CI：0.424～0.613，P＝0.712）；在各指標約登指數(shù)為最大值時對應的靈敏度及特異性分別為：91.2%／82.2%、81.0%／90.9%、79.1%／80.4%、68.8%／61.4%和56.1%／53.7%；對應的臨界值分別為：3.2pmol／L、5.4ng／L、88.7pg／mL、9.2ng／mL和4.9ng／mL（圖1A）。當 聯(lián) 合 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA時，運用Logistics回歸模型將上述TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA這5個指標（變量）擬合后得到的新的變量——“PRE-1值”，而后將“PRE-1值”代入ROC曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合5種指標在區(qū)分NSCLC與肺部良性疾病患者的AUC為0.949（95%CI：0.905～0.998，P＜0.001，圖1B），在“并聯(lián)”檢測時，約登指數(shù)為最大值時的靈敏度和特異性分別為93.6%和86.4%；在“串聯(lián)”檢測時，約登指數(shù)為最大值時的靈敏度為88.7%，特異性為93.0%。

圖1 ROC曲線分析

4 風險評估

多元Logistic回歸分析結果，見表4。單因素分析顯示，血清高TK1、CD147和VEGF水平是NSCLC發(fā)病的危險因素（P＜0.05）；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙和飲酒等因素的影響后，血清高TK1、CD147和VEGF水平仍是NSCLC發(fā)病的獨立危險因素（P＜0.05）。

表4 血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA對NSCLC的預測價值

討 論

肺癌是全球死亡率最高、發(fā)病率增長最快、對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一［1］。NSCLC早期癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時已發(fā)展至中晚期，五年生存率極低［2］。本研究通過對120例確診為NSCLC患者外周血清TK1、CD147和VEGF進行分析，同時聯(lián)合NSCLC相關腫瘤標志物CYFRA21-1和CEA，旨 在 探 討 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA檢測與NSCLC臨床病理特征及在NSCLC診斷中的價值。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清TK1水平是NSCLC發(fā)病的高危因素，對NSCLC的診斷具有較高價值，這些結果與前期李樹林等［14］的研究結果相一致，他們在NSCLC癌組織中檢測到TK1蛋白的高表達，與本次在血清中檢測到的高水平TK1相呼應，我們推測可能的原因是與癌組織細胞向外周循環(huán)中大量釋放TK1有關。TK1是參與DNA前體物質合成的關鍵酶之一，與細胞的生長、分裂密切相關，在腫瘤發(fā)生的早期即出現(xiàn)增高［15］。此外，TK1水平可反映腫瘤細胞的增殖活性，這也解釋了其水平在Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者中的增高最顯著的現(xiàn)象。CD147是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，可通過多種途徑誘導巨噬細胞產生基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），促進腫瘤細胞的侵襲轉移。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CD147在NSCLC患者中的水平顯著高于肺部良性疾病患者，且高水平的CD147與NSCLC的分期相關，這些結果與近年來的報道相呼應。例如，王斯聞等［16］對NSCLC細胞株進行CD147基因沉默后發(fā)現(xiàn)，CD147基因沉默可進一步引起癌細胞內β-catenin、MMP2、MMP9的表達降低與Bax的表達增高，從而抑制細胞增殖和遷移。VEGF是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導腫瘤血管生成，維持腫瘤的繼續(xù)生長。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在NSCLC患者中顯著增高，且其增高水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移相關，這些研究結果與前期李波等［17］報道的結果相一致，他們分別在癌組織和mRNA水平上應用免疫組化及核酸擴增技術分析并發(fā)現(xiàn)VEGF在NSCLC中高表達。值得注意的是，我們分析VEGF水平之所以在Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者體內的水平更高，可能的原因是與Ⅲ～Ⅳ期NSCLC腫瘤生長迅速、血供需求更大有關。

此外，我們還首次探究了聯(lián)合血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA五項指標對NSCLC的診斷及風險評估價值，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合五項指標可顯著提高NSCLC診斷的靈敏度，且TK1、CD147和VEGF三者均為NSCLC發(fā)病的獨立危險因素。值得注意的是，CYFRA21-1和CEA單因素及多因素分析均不是NSCLC的危險因素，我們推測可能的原因為：單因素分析結果顯示CYFRA21-1的OR值為1.31（0.95～1.67），CEA的OR值為1.22（0.96～1.91），雖然提示兩者均不是NSCLC危險因素，但兩者95%CI的下限均接近1，我們認為是由于本研究納入病例的樣本量不足造成。本研究仍有如下不足：①本研究納入的患者均來自于本院，這可能會對研究結果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進一步驗證我們的結果；②本研究納入120例NSCLC患者，納入的例數(shù)仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA在我國NSCLC患者診斷中的臨床價值；③本研究中采用的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA多個指標的聯(lián)合模型雖然較各單獨指標有較高的臨床價值，但該模型的應用仍有待進一步的驗證。

綜上所述，本研究結果表明，聯(lián)合檢測血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA對NSCLC的診斷、發(fā)病風險預測均具有重要意義，有望為NSCLC的臨床診療提供新的途徑。