胡曉蕾，鄒 儀

（成都市西區(qū)醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都610000）

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害，主要為肝炎性肝硬化、酒精性肝硬化以及目前已少見的血吸蟲性肝硬化［1］。由于我國是乙肝大國，病毒性肝炎性肝硬化在臨床上最為常見［2］。晚期肝硬化可導致一系列致命的并發(fā)癥，如上消化道大出血、肝性腦病、肝癌等［3］。尋找可靠的生物學指標對肝硬化患者的病情進行檢測，可有效預防致命性并發(fā)癥的發(fā)生，對肝硬化患者預后的提高具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在消化道腫瘤及肝硬化患者中存在異常表達［3-6］，我們推測三者對肝硬化患者的預后評估具有潛在價值。在本研究中，我們比較了血清高lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平組與對應的低水平組的患者的生存率及病情程度，旨在探究聯(lián)合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標對肝硬化的預后評估價值，以期為肝硬化患者的病情監(jiān)測提供新思路。

材料和方法

1 研究對象

收集2010年1月至2013年1月在我院確診的早期肝硬化患者共330例，年齡36～60歲，平均年齡48.1±12.4歲。研究對象的納入標準如下：①經(jīng)病理學確診為肝硬化；②Child分級均為A級；③均為首次確診為肝硬化，入院前未經(jīng)過其他治療。所有研究對象均排除：呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、心絞痛、心肌梗死等心血管疾病與自身免疫性疾病。Child分級標準參照1972年Pugh修改后的分級標準［7］。由研究人員對研究對象的基本臨床信息如性別、年齡、吸煙史、飲酒史、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）等進行采集。所有納入對象均簽署知情同意書，本研究開展經(jīng)本院倫理委員會批準。

2 血清學指標的檢測

患者入院次日清晨，由專業(yè)醫(yī)護人員使用含促凝劑采血管采集空腹外周血10mL。血液標本在1 h內(nèi)于4℃條件下以12000g離心力離心15min，收集上層血清進行l(wèi)ncRNA MT1JP、CEA、TNF-α與肝纖維化指標III型前膠原（procollagenⅢ，PCIII）、IV型膠原（collegen type IV，IV-C）、層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HA）等的檢測。lncRNA MT1JP的檢測方法為實時熒光定量PCR，檢測儀器為Bio-Rad PCR儀V115883，檢測試劑由康維世紀公司提供。實時熒光定量PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。熒光定量PCR循環(huán)條件：95°C變性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45個循環(huán)，每組設置3個復孔。使用的引物序列為：lncRNA MT1JP上游引物：5’-AGTGT GTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3’下 游引物：5’-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGC TGCATT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAA GGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATA CCAA-3’；采用2-ΔΔCt法計算lncRNA MT1JP的相對表達量，△Ct值＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值。CEA的檢測方法為化學發(fā)光法，檢測儀器為Architect i2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀，檢測試劑為專用配套試劑（美國雅培公司）。TNF-α的檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，檢測儀器為SpectraMax iD5多功能酶標儀（深圳邁瑞公司），試劑盒購自美國ADL公司。肝纖維化指標的檢測均采用羅氏C501全自動生化儀，試劑為羅氏原裝試劑。操作過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。以上所有檢測項目質(zhì)控及標本檢測均嚴格參考儀器及試劑說明書，由本科室專業(yè)人員嚴格把控。

3 隨訪

依據(jù)患者納入本研究的時間，依次對其進行五年隨訪，統(tǒng)計隨訪期間的死亡人數(shù)及對應的死亡時間。隨訪結束后，由專業(yè)醫(yī)護人員對存活患者進行Child分級，并抽取外周靜脈血進行肝纖維化指標的檢測。檢測過程同上。

4 統(tǒng)計學處理

本研究應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均值±標準差（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。率的比較采用卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，應用對數(shù)秩檢驗（log-rank test）計算生存曲線間的統(tǒng)計學差異。應用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析計算三項指標聯(lián)合檢測對肝硬化患者五年內(nèi)存活與否的判別能力，計算曲線下面積（area under the cure，AUC）、靈敏度與特異性。本次實驗的檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平與基本臨床資料

患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平符合正態(tài)分布，三項指標的均值分別為12.77±0.20（-log），8.12±2.08 pg／mL，690.42±93.75μg／L，中位數(shù)分別為12.53（-log），8.88pg／mL，693.17μg／L。依據(jù)血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平對患者進行分組，各組患者的基本臨床資料見表1。如表所示，患者的年齡、性別、BMI、PCIII、IV-C、LN、HA等基本資料的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可比性良好。

表1 患者的基本臨床資料

2 生存分析

經(jīng)過五年隨訪，共有34例患者死亡，0例患者失訪。采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行生存曲線分析，見圖1。相比高lncRNA MT1JP組，低lncRNA MT1JP組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝10.593，P＝0.001，圖1-A）；相比低CEA組，高CEA組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝4.792，P＝0.029，圖1-B）；相比低TNF-α組，高TNF-α組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝13.113，P＜0.001，圖1-C）。

圖1 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平與早期肝硬化患者的生存分析

3 存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級

隨訪結束后，296例存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級見表2。如表所示，相比于高lncRNA MT1JP、低CEA、低TNF-α水平組，低lncRNA MT1JP、高CEA、高TNF-α水平組患者的PCIII、IV-C、LN、HA水平均顯著升高，Child分級中C級患者所占比例顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級

4 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α對肝硬化患者是否生存五年的鑒別診斷

將330例患者分為兩組：五年內(nèi)存活組與五年內(nèi)死亡組。如圖2所示，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在鑒別肝硬化患者是否生存五年的AUC分別為：0.897（95%CI：0.770～0.960，P＜0.001）、0.813（95%CI：0.712～0.921，P＜0.001）和0.648（95%CI：0.570～0.757，P＝0.002）；在各指標約登指數(shù)為最大值時對應的靈敏度及特異性分別為：83.9%／79.6%、76.3%／82.6%和69.1%／58.7%，見圖2-A；聯(lián)合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標在鑒別肝硬化患者是否生存五年的AUC為0.937（95%CI：0.842～0.981，P＜0.001），靈敏度為81.7%，特異性為91.8%，見圖2-B。

圖2 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α對肝硬化患者是否生存五年的鑒別診斷

討 論

我國是乙肝大國，而肝硬化則是慢性乙肝的主要并發(fā)癥之一［8］。早期肝硬化持續(xù)發(fā)展可導致消化道大出血、肝性腦病、肝癌等并發(fā)癥，嚴重威脅患者生命［9］。尋找可靠的指標對早期肝硬化患者的病情進行監(jiān)測，可為肝硬化的臨床干預提供依據(jù)，對其并發(fā)癥的預防具有重要意義。

lncRNA MT1JP是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，可通過調(diào)節(jié)靶基因轉錄后的水平參與腫瘤的生物學功能，目前已在胃癌、結腸癌等消化道腫瘤中檢測到lncRNA MT1JP低表達，并起著抑癌基因的作用［10］。LIU等［10］應用基因芯片技術對包括肝癌、肺癌、胃癌及結腸癌等76對癌及癌旁消化道腫瘤患者組織中檢測lncRNA MT1JP水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，癌組織中l(wèi)ncRNA MT1JP水平顯著降低。進一步的機制研究，他們還發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53是lncRNA MT1JP的靶基因，當lncRNA MT1JP下調(diào)時，人正常肝細胞L02和肝癌細胞HepG2中p53蛋白水平下降，進而加速細胞惡化和腫瘤形成。肝硬化的重要并發(fā)癥即是癌變，而早前的研究也指出，p53參與肝硬化的進程。KOUTB等［11］發(fā)現(xiàn)，與對照者相比丙型肝炎性肝硬化患者血漿p53基因顯著下調(diào)。綜合上述研究可以推測，lncRNA MT1JP通過正向調(diào)控p53，參與肝硬化的發(fā)生發(fā)展。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清低lncRNA MT1JP水平肝硬化患者的生存率顯著降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纖維化程度指標的水平及Child分級中C級患者比例均顯著升高，該結論與我們的假設相一致，表明血清高lncRNA MT1JP水平是肝硬化的一種保護因素。CEA是一種廣譜的腫瘤標志物，在消化道腫瘤患者中的表達水平增高［12］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CEA在肝硬化患者體內(nèi)亦存在異常表達。例如，戚玉海等［13］檢測了38例慢性乙型肝炎與57例肝硬化患者的血清CEA水平，發(fā)現(xiàn)CEA在肝硬化失代償期時明顯升高，對判斷肝硬化病情有一定參考意義。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)，相比于低水平組，血清高CEA水平組的肝硬化患者的五年生存率降低，這些研究結果提示，CEA除可用作腫瘤標志物外，還具有用于肝硬化病情監(jiān)測的潛能。TNF-α是由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的能殺死腫瘤細胞的一種活性物質(zhì)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α對肝硬化的臨床轉歸有一定參考價值。劉德福等［15］對120例肝硬化患者的腹水TNF-α水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，乙肝肝硬化患者首次腹水中TNF-α水平增高是提示患者預后不良的重要因素，具有重要的臨床預測價值。這一結論在國外研究中也被證實［16］。NAGAI等［16］指出，血清TNF-α水平可用于評估肝硬化患者接受索拉非尼治療的療效評估，且當索拉非尼用量在400 mg／d時患者血清TNF-α下降最為顯著，治療效果也最明顯。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)，血清高TNF-α水平組的肝硬化患者的五年生存率降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纖維化程度指標的水平及Child分級中C級患者比例均顯著升高，該研究結果與前期國內(nèi)外研究相呼應，表明高TNF-α是肝硬化患者不良預后的因素之一。

此外，血清高lncRNA MT1JP與低CEA、低TNF-α水平組肝硬化患者的肝纖維化指標PCIII、IVC、LN、HA在五年內(nèi)的變化不大，而低lncRNA MT1JP與高CEA、高TNF-α水平組肝硬化患者的肝纖維化指標則顯著增高，且Child分級中C級患者所占比例亦顯著升高，這些結果提示，lncRNA MT1JP可延緩肝纖維化進程，而CEA與TNF-α則可加速肝纖維化化進程，三者有望成為肝纖維化的治療靶標。

綜上所述，本研究探究了血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標對早期肝硬化的預后評估價值，有望為肝硬化的臨床診療提供新思路。