畢日軍，郗彥鳳

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原030001；2.山西省腫瘤醫(yī)院病理科，山西 太原030013）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的組織學(xué)類型，占甲狀腺惡性腫瘤的80%，而且近年來發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)［1］。一般來說，PTC患者通過手術(shù)切除，并結(jié)合放射性碘療法，有一個(gè)良好預(yù)后，5年總生存率大約為95.0%。但是一部分PTC患者初步治療后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和／或轉(zhuǎn)移。因此，鑒別PTC患者不良預(yù)后有非常重要的意義。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種170 kDa細(xì)胞表面糖蛋白。與配體結(jié)合后，EGFR激活細(xì)胞內(nèi)MAPK和PI3K／A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)增殖、生存、血管生成和遷移等［2］。由受體過度表達(dá)、自分泌配體刺激或激活突變導(dǎo)致EGFR信號(hào)通路紊亂在一些腫瘤中發(fā)揮作用，與以轉(zhuǎn)移為特征的晚期惡性腫瘤和預(yù)后不良相關(guān)［3］。黏附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體酪氨酸激酶，與癌癥進(jìn)展有關(guān)。在癌細(xì)胞中，F(xiàn)AK／Src復(fù)合物增加會(huì)增強(qiáng)EGFR對(duì)MAPK和PI3K的激活，從而增強(qiáng)繁殖、生存、遷移能力和轉(zhuǎn)移［4］。高水平FAK與人類多種腫瘤侵襲性相關(guān)，包括甲狀腺癌［5］。為更好了解EGFR及其下游效應(yīng)物FAK在甲狀腺癌進(jìn)展中表達(dá)情況，本文在PTC樣本中檢測(cè)EGFR和FAK蛋白表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過程中EGFR和FAK的變化。

材料和方法

1 臨床資料

收集2016年6月至2018年12月在我院行PTC切除手術(shù)的52例患者組織樣本，患者平均年齡為49.8±8.4（39～78）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者手術(shù)前未進(jìn)行任何放化療治療；②經(jīng)兩位副高以上職稱病理醫(yī)師同時(shí)診斷；③符合WHO對(duì)PTC診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①應(yīng)用免疫抑制劑治療患者；②有風(fēng)濕性免疫系統(tǒng)疾病；③合并惡性腫瘤；④癌灶較小不能進(jìn)行連續(xù)切片；⑤排除出血、感染及壞死嚴(yán)重者。所有患者或其家屬均簽署知情同意書。醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

2 免疫組化分析

PTC或轉(zhuǎn)移性淋巴組織樣本經(jīng)10%多聚甲醛固定，30%蔗糖在4°C脫水。把脫水后的組織放在預(yù)冷的鐵片上，OCT包埋。冰凍切片，厚度為10μm，貼片。免疫組化染色用親和素-生物素技術(shù)進(jìn)行。一抗是多克隆兔抗EGFR和FAK（美國(guó)Sigma公司），二抗是生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）?？贵w反應(yīng)后，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察免疫組化染色。

3 免疫組化結(jié)果評(píng)價(jià)

腫瘤切片由兩個(gè)對(duì)臨床結(jié)果一無所知病理科大夫觀察。免疫反應(yīng)性半定量評(píng)價(jià)包括強(qiáng)度和分布。染色評(píng)分如下：0為無染色；1為弱廣泛分布或腫瘤細(xì)胞局部（高達(dá)40%）染色；2為中等，腫瘤細(xì)胞中超過40%染色；3為強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞彌漫染色。樣本評(píng)分為0和1是低表達(dá)，2和3是高表達(dá)。典型染色圖片如圖1和圖2所示。

圖1 PTC中EGFR免疫組化表達(dá)

圖2 PTC中FAK免疫組化表達(dá)

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析EGFR和FAK表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性。采用Spearman相關(guān)性分析評(píng)估EGFR和FAK免疫組化染色強(qiáng)度的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PTC中EGFR和FAK蛋白表達(dá)水平分析

PTC患者分為兩類：低表達(dá)（染色得分0和1）和高表達(dá)（染色評(píng)分2和3）患者。52例患者中有29例（55.8%）EGFR高表達(dá)，有30例（57.7%）FAK高表達(dá)。通過Fisher精確檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)檢驗(yàn)證實(shí)EGFR和FAK表達(dá)顯著正相關(guān)（r＝0.805，P＜ 0.001）（表1）。

表1 PTC中EGFR和FAK蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析（n＝52）

2 EGFR與FAK表達(dá)與PTC臨床病理參數(shù)相關(guān)性

我們進(jìn)一步評(píng)估PTC中EGFR和FAK蛋白表達(dá)及臨床病理參數(shù)相關(guān)性（表2和表3）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，PTC中EGFR和FAK高表達(dá)與年齡和性別無相關(guān)性。EGFR和FAK高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵襲和晚期pT顯著相關(guān)（P＜0.05）。EGFR和FAK高表達(dá)與TNM分期無相關(guān)性。EGFR和FAK高表達(dá)在不同組織分型PTC中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表2 PTC中EGFR蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)分析

表3 PTC中FAK蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)分析

3 EGFR和FAK共表達(dá)與PTC病理參數(shù)相關(guān)性

下面進(jìn)一步分析高水平EGFR和FAK共表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺外浸潤(rùn)相關(guān)性（表4）。結(jié)果顯示，高水平EGFR和FAK共表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺外浸潤(rùn)顯著相關(guān)。52例PTC患者中，24例患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例患者甲狀腺外浸潤(rùn)。24例轉(zhuǎn)移性PTC中有20例患者高水平EGFR和FAK共表達(dá)；20例甲狀腺外浸潤(rùn)患者中有16例患者高水平EGFR和FAK共表達(dá)，陽性率分別為83.3%和80.0%。因此，高水平EGFR和FAK蛋白單獨(dú)或共同表達(dá)與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺外浸潤(rùn)顯著相關(guān)。

表4 高水平EGFR和FAK共表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺外浸潤(rùn)相關(guān)性

4 原發(fā)PTC及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中EGFR和FAK免疫組化分析

采用免疫組化分析10例PTC原發(fā)腫瘤及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織EGFR和FAK蛋白表達(dá)。與原發(fā)PTC相比較，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織EGFR和FAK均表現(xiàn)為高表達(dá)，其中90%淋巴組織高表達(dá)EGFR；80%淋巴組織高表達(dá)FAK（表5）。表明EGFR和FAK在PTC淋巴擴(kuò)散過程中均為高表達(dá)。

表5 原發(fā)PTC及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中EGFR和FAK免疫組化表達(dá)情況（n＝10）

討 論

本研究結(jié)果證實(shí)，原發(fā)性PTC及相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴組織中EGFR和FAK共同高水平表達(dá)，可能與PTC進(jìn)展相關(guān)。此外，結(jié)果也支持EGFR及其下游效應(yīng)器FAK，在PTC侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路參與人類腫瘤細(xì)胞進(jìn)展，在一些人類惡性腫瘤中與侵襲性生物學(xué)行為和不良臨床后果有關(guān)［6-7］。關(guān)于甲狀腺癌，EGFR在未分化甲狀腺癌中上調(diào)，與去分化、侵襲性表型和不良預(yù)后相關(guān)［8］。在PTC中，EGFR高表達(dá)與患者不良臨床病理特征，如局部侵襲性和轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散相關(guān)［9］。在甲狀腺癌細(xì)胞中，配體與EGFR結(jié)合后可激活ERK和AKT通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而且能夠避免程序性細(xì)胞死亡，增強(qiáng)遷移及轉(zhuǎn)移能力。此外，已經(jīng)證實(shí)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲是由EGFR下游基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）的 激 活 進(jìn) 行 調(diào) 節(jié)［10］。EGFR和FAK上述幾項(xiàng)研究提示EGFR、MMPS和FAK之間的功能聯(lián)系，可影響惡性細(xì)胞遷移及侵襲。

FAK是一種與癌癥進(jìn)展相關(guān)的非受體酪氨酸激酶，可整合生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外信號(hào)基質(zhì)，是整合素依賴的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及促生長(zhǎng)因子中效應(yīng)分子信號(hào)通路的調(diào)控因子［11］。在癌細(xì)胞中，F(xiàn)AK／SRC復(fù)合體增加可激活MAPK和PI3K信號(hào)通路，此外EGFR也可激活MAPK和PI3K信號(hào)通路，均可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、生存和遷移能力［2］。FAK／SRC復(fù)合體使酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)，從而能夠調(diào)節(jié)惡性細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路。FAK在甲狀腺癌中高表達(dá)，但在非惡性組織中低表達(dá)，而且與侵襲性表型相關(guān)［12］。體外研究表明，MMPS、FAK與EGFR激活有關(guān)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，抑制FAK表達(dá)或活性可阻止EGFR調(diào)節(jié)的侵襲性，并降低人肺腺瘤細(xì)胞A549中MMP-9活性，提示FAK通過調(diào)節(jié)MMP-9促進(jìn)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［13］。在乳腺癌細(xì)胞中，聚甲醛酸通過減少FAK磷酸化和MMP-9表達(dá)抑制EGFG誘導(dǎo)的侵襲、遷移和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力［14］。同樣，也有報(bào)道，EGFR刺激體外甲狀腺惡性細(xì)胞中FAK磷酸化和MMP-9表達(dá)［15］。抑制EGFR信號(hào)通路可抑制MMP-9表達(dá)和FAK磷酸化，而FAK反義寡核苷酸處理可抑制MMP-9表達(dá)和隨后的細(xì)胞侵襲，從而證明它與侵襲直接相關(guān)。我們的結(jié)果也提示FAK在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用。

總之，本研究結(jié)果表明，EGFR及其下游效應(yīng)器FAK蛋白高表達(dá)，與PTC淋巴擴(kuò)散和腫瘤浸潤(rùn)相關(guān)，這表明EGFR和FAK均參與了PTC進(jìn)展。因而EGFR和FAK兩種分子可能用于預(yù)測(cè)PTC的侵襲性。此外，評(píng)估組織樣本中EGFR和FAK表達(dá)可能有助于PTC患者術(shù)前的危險(xiǎn)分級(jí)。