李 珺 張 義

(復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 上海 200240)

泌乳素(prolactin,PRL)腺瘤是激素分泌性腺瘤中最常見的一種,約占垂體腺瘤的 30%,部分腫瘤雖為良性,但仍有侵襲性生長的惡性腫瘤表現(xiàn)。男性患者臨床表現(xiàn)與女性不同,女性的泌乳素腺瘤大多是微腺瘤,男性則有就診年齡大、腫瘤大、泌乳素水平高和腫瘤侵襲性生長等特點[1]。妊娠和雌激素替代療法也會導致泌乳素瘤增大[2-3]。泌乳素腺瘤全切率低,與其他類型的垂體腺瘤相比具有更快的侵襲速度[4],因此臨床預后差。尋找敏感的生物標志物將有助于鑒定泌乳素瘤的侵襲性,協(xié)助臨床治療。

眾所周知,雌激素受體(estrogen receptor,ER)與垂體腫瘤侵襲作用密切相關(guān)[5-6]。但是很早就有學者提出傳統(tǒng)ER并不足以完成雌激素的全部作用[7-8]。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)是一種由GPER基因編碼的蛋白質(zhì),曾被稱作G蛋白偶聯(lián)受體30。GPER1與雌二醇結(jié)合并被其激活,發(fā)揮其獨立于傳統(tǒng)ER并且快速的受體作用,因此被視為具有獨立作用的新型ER[9-10]。研究表明,GPER1與GPER雌激素結(jié)合后,不依賴傳統(tǒng)途徑,可以快速活化細胞內(nèi)第二信使信號,參與雌激素非核效應(yīng)調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。已知GPER1在乳腺癌細胞中具有抑制作用,其表達減少可造成乳腺癌進展,但在其他雌激素相關(guān)腫瘤的作用尚不明確。本研究采用免疫組化和熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法研究侵襲性泌乳素腺瘤中GPER1基因表達的變化,為泌乳素腺瘤侵襲機制提供新的理論基礎(chǔ),可為未來的基因治療提供新的靶點[13],為尋找新的分子生物標志物評價泌乳素瘤的侵襲性提供理論依據(jù)。

資 料 和 方 法

臨床病例資料選取2012—2017年復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的泌乳素腺瘤患者共102例,根據(jù)其頭顱MR表現(xiàn)參考Knosp[14]方法分為侵襲性泌乳素腺瘤組(侵襲組)和非侵襲性泌乳素腺瘤組(非侵襲組)。排除標準:(1)接受2次手術(shù)治療;(2)使用溴隱亭治療。102例患者中,80例最終納入研究,其中侵襲組37例、非侵襲組43例。詳細記錄各例患者性別、年齡及術(shù)前泌乳素水平。

本研究獲復旦大學第五人民醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:2012[021])。所有患者均簽署知情同意書。本研究按照《赫爾辛基宣言》原則進行。

免疫組化手術(shù)切除垂體瘤標本制成蠟塊,制作4.0 μm切片進行免疫組化實驗。免疫組織化學采用LSAB法(labeled streptavidin-biotin,抗生物素蛋白鏈菌素-生物素標記法)。GPER1一抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。通用型SP-Kit和DAB由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。PBS代替一抗為陰性對照。

組化實驗由兩名病理實驗員同時進行,實驗員對患者資料并不知情。染色結(jié)果進行HPF半定量分析:以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分。組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞標志。具體評分標準見表1,標準組化示例見圖 1。

表1 GPER1 免疫組化染色 HPF 半定量分析評分法Tab 1 GPER1 immunohistochemical staining HPF semi-quantitative analysis scoring method

A:Weak positive;B:Mid positive;C:Strong positive.

圖 1 HPF 半定量分析標準組化示例(×400)
Fig 1 HPF semi-quantitative analysis standard sample (×400)

熒光實時定量多聚酶鏈反應(yīng)將組織樣本在無RNA酶的研缽中液氮研磨,Trizol(lot A7205-1,大連TaKaRa生物有限公司)充分裂解細胞提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(lot EP0441,上海賽默飛世爾科技有限公司)和oligo dT (lot S1316S,上海NEB公司)根據(jù)操作說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。引物設(shè)計為GPER1(正向):5’-GCA GGT CCA GCA GAG GTA CA-3’,GPER1 (反向):5’-TGG TTT GGG TTG GGT TTG TTA-3’ (278bp);甘油醛 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH) (正向):5’-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TG-3’,GAPDH (反向):5’-GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT-3’(145 bp)。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用目的基因特異性引物和內(nèi)參引物擴增待檢測的目的基因片段和看家基因,摸索適合qPCR上機的最佳引物退火溫度和模板量,若有雜帶應(yīng)重新調(diào)整PCR過程中的退火溫度,直至雜帶消失。最后以GAPDH作為內(nèi)部控制,使用SYBR Green Mix(中國廣州東盛生物科技有限公司)在Eppendorf Mastercycler ep Realplex 熒光定量PCR系統(tǒng)中(德國漢堡 Eppendorf 生物技術(shù)公司)進行特異性mRNA定量Real-time PCR實驗。所有反應(yīng)包括在95 ℃初始變性2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,然后 72 ℃ 20 s循環(huán)40次。計算2-ΔΔCT代表相對目標基因的mRNA水平。

結(jié) 果

臨床資料分析侵襲組病例37人,非侵襲組病例43人,患者的臨床特點及其術(shù)前泌乳素水平見表2。侵襲組平均年齡與非侵襲組平均年齡比較無統(tǒng)計學差異(P=0.94)。侵襲組女性17人,男性20人;非侵襲組女性25人,男性18人。侵襲組術(shù)前泌乳素水平與非侵襲組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.869)。

表2 侵襲組與非侵襲組泌乳素腺瘤患者臨床數(shù)據(jù)分析Tab 2 Characteristics of prolactinomas patients with or without invasive tumor

免疫組化結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示瘤細胞質(zhì)中出現(xiàn)的黃色顆粒為GPER1蛋白質(zhì)。放大400倍光鏡觀察侵襲性垂體瘤組織標本中表達較少,顏色偏淡,多呈淡黃色;在非侵襲性垂體瘤組織標本中顏色濃郁,多呈深褐色。通過計算,侵襲組蛋白質(zhì)陽性度平均值較非侵襲組低,侵襲組為3.8 (2.2～6.6),非侵襲組為11.2 (6.0～12.0)(P<0.001,圖2)。為了去除混雜因素影響,本研究還針對兩組不同的臨床特征可能對GPER1表達產(chǎn)生影響的因素進行了統(tǒng)計比較,結(jié)果顯示不同性別的泌乳素腺瘤患者GPER1蛋白質(zhì)水平未見明顯差異,表3顯示GPER1蛋白質(zhì)水平僅與垂體瘤侵襲行為有關(guān),與其他臨床特征無關(guān)。

A:GPER1 protein staining in invasive pituitary tumor showing weak staining (+) (×400).B:GPER1 protein staining in non-invasive pituitary tumor showing strong staining (+++) (×400).C:Box-plot of GPER1 protein expression in male and female prolactinomas patients (data reported as median and IQR);D:Box-plot of GPER1 protein expression in prolactinomas patients with invasive or not (data reported as median and IQR).

圖2 泌乳素腺瘤患者GPER1蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果
Fig 2 Immunohistochemical results of GPER1 protein in patients with prolactin adenoma

表3 兩組間不同臨床特征的 GPER1 蛋白質(zhì)水平的陽性度平均值比較Tab 3 Grade distribution of GPER1 protein level in prolactinomas patients with different characteristics [n (%)]

熒光實時定量多聚酶鏈反應(yīng)非侵襲組GPER1 mRNA水平為1.93 (1.00～4.70),顯著高于侵襲組[0.47 (0.03～2.30)],差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021,圖 3)。此結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。

Data reported as median and IQR.

圖3 real-time RT-PCR分析兩組患者
相對GPER1 mRNA 水平
Fig 3 Relative GPER1 mRNA level in patients of twogroups by real-time RT-PCR

Cox 比例風險模型將侵襲組與非侵襲組各患者的年齡、性別、瘤體大小、術(shù)前血清泌乳素水平及GPER1 mRNA基因水平與垂體瘤復發(fā)時間做相關(guān)性分析(表4、圖4)。按照 GPER1 mRNA水平分組,校正年齡和腫瘤大小之后發(fā)現(xiàn),不同表達水平的GPER1對腫瘤復發(fā)的影響差異無統(tǒng)計學意義(P=0.48)。

表 4 Cox 比例風險模型對GPER1 mRNA水平與患者預后的相關(guān)性分析結(jié)果Tab 4 The relationship of GPER1 mRNA level with the prognosis of patients by Cox proportional risk model analysis

討 論

泌乳素腺瘤是一種常見的垂體腫瘤,雌激素在其發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。GPER1屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs),其作用獨立于雌激素受體(ER)α 和(ER)β。GPER1刺激增加產(chǎn)生GPER1 Gαs。此外,GPER1的激活導致肝素結(jié)合生長因子(HB-EGF)的激活和釋放,進而激活表皮生長因子受體,然后磷酸化MAPK[16]。

The effect of different levels of GPER1 mRNA on tumor recurrence was not statistically significant,P=0.48.

圖4 不同 GPER1mRNA 水平患者復發(fā)生存曲線(校正年齡和腫瘤)
Fig 4 Recurrence survival curve of patients with differentGPER1 mRNA levels (adjusted for age and tumor size)

2014年 Lappano等[17]研究了GPER1 (又稱GPR30)受體在不同的細胞類型中對雌激素信號的影響,發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體的激活是GPER1觸發(fā)的生物作用中的一個基本整合點。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn),天然和合成雌激素可激活GPER1,并在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中起作用。還有研究表明,雌激素與GPER1特異性配體G.1結(jié)合可調(diào)控ERKl、ERK2等信號通路,從而進一步影響細胞增殖[18-22]。有研究表明,GPER1表達的大鼠初級精子細胞與GPER1結(jié)合后,E2、G.1可激活EGFR/ERK/c-Jun通路,進一步調(diào)控細胞基因表達[22]。其他學者[23-24]的實驗研究再次強調(diào)了GPER1在癌細胞侵襲時的抑制作用。本研究與上述研究結(jié)論相符,GPER1 表達降低的腫瘤侵襲性增高。

然而,GPER1的具體作用通路尚不清楚,GPER1基因的低表達的機制是什么,仍是研究的熱點。Manjegowda等[25]的研究分析了不同乳腺癌細胞中GPER1 mRNA的水平,使用RT-PCR檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞中GPER1基因座兩個CpG島的甲基化狀態(tài),通過改良COBRA法和亞硫酸氫鹽測序法檢測GPER1 mRNA。結(jié)果表明,MCF-7細胞GPER1 mRNA表達水平較高,與MDA-MB-231細胞相比,COBRA檢測顯示GPER1 mRNA表達水平存在差異甲基化。結(jié)果證明了DNA甲基化在 GPER1 抑制中的作用。

細胞研究證實,GPER/ERK信號通路與細胞生長、存活和遷移有關(guān)[26]。Jiang等[27]的體外實驗研究證實雌激素信號與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān),可能通過 GPER1/ERK&AKT/NFκ-B/引發(fā)CXCR1 的級聯(lián)反應(yīng)。有關(guān)GPER在激素分泌性垂體腺瘤中的分子機制研究報道較少,可能是將來研究的重點。此外,參與泌乳素瘤侵襲行為的還有基質(zhì)金屬蛋白酶[28]和芳香化酶細胞色素 P450[29],它們與GPER1的關(guān)系有待研究。

由于泌乳素腺瘤女性患者多見,為了排除性別的干擾,我們將性別進行統(tǒng)計對比,結(jié)果表明侵襲組及非侵襲組GPER1的表達與性別無關(guān)。我們還對比了年齡、瘤體大小以及術(shù)前血清泌乳素水平對GPER1基因表達的影響,最后證實GPER1基因表達僅與垂體瘤侵襲性有關(guān),與其他臨床特征無關(guān)。

本研究按照GPER1 mRNA水平分組,校正年齡和腫瘤大小之后發(fā)現(xiàn),不同表達水平的GPER1對腫瘤復發(fā)的影響并不具有統(tǒng)計學意義。這種結(jié)果可能是由于泌乳素垂體瘤并不是惡性程度高的腫瘤,復發(fā)率不高,結(jié)局發(fā)生數(shù)較少造成的,需要在大樣本人群隊列中進一步驗證。

本研究存在一定的局限性。本文僅研究了泌乳素腺瘤GPER1基因的表達,未對和侵襲性作用相關(guān)的其他蛋白質(zhì)進行更全面的研究和對比。無法通過多變量分析充分調(diào)查泌乳素瘤侵襲的危險因素。

目前泌乳素腺瘤的手術(shù)治療及隨訪仍存在很大的挑戰(zhàn)。因此研究更為敏感的生物標志物如GPER1為評判泌乳素垂體瘤的侵襲性和泌乳素垂體瘤的綜合治療提供科學依據(jù)。