張萌 劉國林 李向龍 陳永宏 白玲榮 羅芳 李亞超 陶金忠

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

圍產(chǎn)期是奶牛最重要的時期，同時也是奶牛能量代謝病的高發(fā)時期［1］。圍產(chǎn)期奶牛動員脂肪組織，導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌因子增加和免疫狀態(tài)發(fā)生改變。神經(jīng)內(nèi)分泌因子增加促進(jìn)非酯化脂酸（Non-esterified fatty acids，NEFA）和甘油進(jìn)入血液及肝臟，從而引起由脂肪代謝產(chǎn)生一系列變化，導(dǎo)致能量代謝障礙性疾?。?］。而免疫力降低，奶牛抵御外來入侵能力減弱，影響圍產(chǎn)期奶牛健康狀況，易發(fā)各種產(chǎn)科疾病發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟損失。

黃芪味甘性溫，歸脾、肺經(jīng)，屬補氣藥物，具有保護心肌細(xì)胞、強心肌、降低血脂、提高免疫功能等藥理作用［3-4］。黃芪含有多糖類、皂苷類、黃酮類和氨基酸類等多種活性成分。其中黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降血糖及抗衰老等功效［5-6］。據(jù)報道，黃芪多糖粉可提高奶牛機體的免疫功能［7］，被作為免疫增強劑應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖［8］。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵黃芪粉可以顯著提高奶牛乳蛋白率，提高奶牛血清總抗氧化能力［9-10］。黃芪莖葉生物發(fā)酵物可以提高奶牛產(chǎn)奶量和降低乳房炎發(fā)病率［11］。劉超等［12］發(fā)現(xiàn)黃芪具有調(diào)節(jié)小鼠高脂血癥脂代謝和增強抗脂質(zhì)過氧化的作用。山楂為薔薇科植物的干燥成熟果實。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實山楂中降血脂的主要活性成分為山楂黃酮和三萜類物質(zhì)［13］，也有研究發(fā)現(xiàn)山楂活性成分果膠五糖有降血脂作用［14］。朱光等［15］研究發(fā)現(xiàn)山楂善消肉食油膩之積，對降脂具有很好療效。目前應(yīng)用山楂對大小鼠研究較為深入，用于反芻動物研究較少。吳志嵩等［16］以山楂山藥湯對高脂血癥小鼠血脂水平的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)山楂可降低脂類及膽固醇的濃度。林秋實等［17］發(fā)現(xiàn)山楂及山楂黃酮能顯著降低大鼠血清總膽固醇，降低低密度脂蛋白-膽固醇，顯著升高高密度脂蛋白-膽固醇。在免疫方面，高東雁等［18］以山楂煎劑對大鼠細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用，減少炎性細(xì)胞浸潤和腎組織的炎癥反應(yīng)［19］。

為此，本研究通過對產(chǎn)前奶牛日糧中添加山楂和黃芪混合物，探究對奶牛血漿代謝物的變化情況，探討山楂、黃芪對圍產(chǎn)期奶牛的影響因素，為了解山楂、黃芪維持圍產(chǎn)期奶牛健康狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器設(shè)備 1290 UHPLC超高效液相（美國Agilent公司）、Triple TOF 6 600高分辨質(zhì)譜（AB Sciex）、QTOF 6550高分辨質(zhì)譜（美國Agilent公司）、Heraeus Fresco17離心機（Thermo Fisher Scientific）、BSA124S-CW 天平（Sartorius）、JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信科技有限公司）、明澈D24 UV純水儀（Merck Millipore）、PS-60AL超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）、ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm 色譜柱（Waters）。

1.1.2 試驗材料與試劑 67-56-1甲醇Methanol（CNW Technologies）、75-05-8 乙腈 Acetonitrile（CNW Technologies）、631-61-8醋 酸 銨 Ammonium acetate（CNW Technologies）、1336-21-6氨 水 Ammonium hydroxide（CNW Technol-ogies）、103616-89-3 L-2-氯苯丙氨酸2-Chloro-L-phenylalanine（上海恒柏生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物和分組 在寧夏某大型奶牛場，選擇20頭2-4胎、預(yù)產(chǎn)期相近、年齡和體況相近（體況評分BCS3.0-3.5）和上一個產(chǎn)奶周期產(chǎn)奶量相近的健康荷斯坦奶牛。根據(jù)預(yù)產(chǎn)期（妊娠天數(shù)280 d）計算圍產(chǎn)期，于產(chǎn)前21±3 d進(jìn)入圍產(chǎn)圈，開始試驗。隨機分為2組，對照組A組（n=10）：對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，日糧配方見表1。試驗組B組（n=10）：試驗組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加山楂和黃芪各150 g，每日投料3次（每日6：00、12：00和19：00投料），全混合日糧（Total mixed ration，TMR）飼喂，自由飲水，連續(xù)飼喂14 d（試驗期間奶牛未產(chǎn)犢牛）。

表1 圍產(chǎn)前期奶?；A(chǔ)日糧組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2.2 血液的采集保存 于試驗第14天晨飼前（5：00-6：00）尾靜脈采集血液10 mL，肝素鈉抗凝，迅速3 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，置于-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。

1.2.3 檢測方法

（1）代謝物提取 取100 μL樣本，加入400 μL含有內(nèi)標(biāo)的提取液（甲醇乙腈體積比=1∶1，內(nèi)標(biāo)濃度 5 μg/mL），渦旋混勻 30 s；超聲 5 min（冰水?。?；零下20℃靜置1 h；將樣本4℃，12 000 r/min離心15 min；小心地取出425 μL上清于EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入100 μL提取液（乙腈水體積比：1∶1）復(fù)溶；渦旋30秒，冰水浴超聲10 min；將樣本4℃，12 000 r/min離心15 min；小心地取出60 μL上清于2 mL進(jìn)樣瓶，每個樣本各取10 μL混合成QC樣本，再取60 μL上機檢測。

（2）上機檢測 安捷倫1290超高效液相控制下按照表2中的流動相參數(shù)進(jìn)行分析。所使用的色譜柱為購自Waters的UPLC BEH Amide 色譜柱（1.7 μm×2.1×100 mm）。進(jìn)樣體積為 2 μL。

表2 液相色譜流動相條件

AB 6600 Triple TOF & Agilent 6550 QTOF質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進(jìn)行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，15張二級譜圖每50 ms。ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓（GS1）：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650℃，噴霧電壓：5 000 V（正離子模式）或-4 000 V（負(fù)離子模式）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析 使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始轉(zhuǎn)成mzXmL各式。再使用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，minfrac設(shè)為0.5，cutoff設(shè)為0.6。同時使用自撰寫R程序包和自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

對數(shù)據(jù)的完整性進(jìn)行檢查，對缺失值進(jìn)行刪除或者補充，刪除極值，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本間和代謝物間的歸一化處理，以確保各樣本之間和代謝物之間可平行比較。對XCMS提取得到的數(shù)據(jù)，進(jìn)行刪除組內(nèi)缺失值＞50%的離子峰，不參與后續(xù)分析。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化后，使用SIMCA-P軟件中對數(shù)據(jù)進(jìn)行pareto-scaling處理后，進(jìn)行多元統(tǒng)計分析：包括主成分分析（Principal component analysis，PCA），正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA）；同時在建模過程中對模型數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗并計算變量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）。在此基礎(chǔ)上對數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量統(tǒng)計分析包括：Students t-test 和變異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）分析，利用R軟件根據(jù)各代謝物P值和FC值繪制火山圖。

1.2.5 差異代謝物鑒定和生物學(xué)信息學(xué)分析 以VIP＞1、P＜0.05和 FC＞1.3或 FC＜0.77作為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著性差異代謝物，以VIP＞1和0.05＜P＜0.1作為差異趨勢性代謝物，采用質(zhì)荷比精確匹配（誤差＜25 ppm）和二級質(zhì)譜圖檢索比對本地數(shù)據(jù)庫的方法鑒定差異代謝物。代謝物數(shù)據(jù)使用MetaboAnalyst平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)auto-scaling（以均值為中心，除以每個變量的標(biāo)準(zhǔn)差）標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行聚類和KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝譜分析

由圖1可以看到，QC樣本TIC出峰保留時間和峰面積都重疊很好，說明儀器穩(wěn)定性很好。從圖2和圖3可以看到QC樣本密集分布，說明本次實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量很高，并且在正負(fù)離子PCA-X一維分布圖，可以看出所有QC樣本分布于3STD之內(nèi)，說明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

圖1 QC樣本TIC圖

圖2 正離子和負(fù)離子PCA得分圖

圖3 正離子模式和負(fù)離子模式下QC樣本PCA-X一維分布圖

2.2 多元統(tǒng)計學(xué)分析

經(jīng)pareto-scaling處理后，進(jìn)行模式識別。分析A組和B組用以篩選飼喂山楂、黃芪后兩組奶牛的差異代謝物。由圖4可知，A與B組數(shù)據(jù)在負(fù)離子模式下有一定分離趨勢，正離子模式下R2X=0.554，負(fù)離子模式下R2X=0.722。為了進(jìn)一判定兩組是否有著差異，構(gòu)建有監(jiān)督模型OPLS-DA。對數(shù)據(jù)進(jìn)行濾除和修正得到OPLS-DA模型，模型得分圖如圖5所示。OPLS-DA模型參數(shù)正離子模式下R2Y=1和Q2=0.6，負(fù)離子模式下R2Y=0.937和Q2=0.625，R2Y和Q2均大于0.5，說明模型解釋率和預(yù)測能力高，模型穩(wěn)定可靠。由圖6可知，正離子模式數(shù)據(jù)置換檢驗Q2截距 =-0.119（Q2intercept＜0），負(fù)離子模式Q2截距 =-0.369（Q2intercept＜0），說明模型未過度擬合。

圖4 A組和B組在正負(fù)離子模式下的PCA得分圖

2.3 差異代謝物的篩選

圖5 A組和B組兩組OPLS-DA得分圖

圖6 A組和B組兩組置換檢驗圖

對預(yù)處理后的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量統(tǒng)計分析，根據(jù)t檢驗中的P值和變異倍數(shù)分析中FC值繪制火山圖。由圖7可知，在正負(fù)離子模式下檢測的代謝譜呈正態(tài)分布，可進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定。根據(jù)t檢驗中的P值和OPLS-DA模型獲得的VIP值。以 OPLS-DA 模型獲得 VIP＞1、P＜0.05和 FC＞1.3或FC＜0.77作為顯著性差異代謝物篩選條件，以VIP＞1和0.05＜P＜0.1作為差異趨勢代謝物。篩選A組和B組的差異代謝物共有60種代謝物，其中正離子模式和負(fù)離子模式顯著性差異代謝物分別有16和15個，差異趨勢代謝物分別有19和10個。正離子模式下顯著性差異代謝物2個顯著低于對照組，14個顯著高于對照組（P＜0.05）；負(fù)離子模式下顯著性差異代謝物15個顯著低于對照組（P＜0.05）。顯著性差異代謝物如表3和表4所示。

圖7 A組和B組代謝物譜火山圖表

2.4 生物信息學(xué)分析和生物標(biāo)記物篩選

使用MetaboAnalyst分析平臺分別A組和B組篩選出的顯著性差異代謝物進(jìn)行聚類分析和KEGG代謝通路分析。由圖8可知，A組和B組中數(shù)據(jù)有明顯的聚集趨勢，沒能完全聚集在一起可能試驗樣本組內(nèi)有個別樣本存在差異；由圖9中KEGG通路分析結(jié)果可知A組和B組顯著性差異代謝物參與20種不同代謝通路，其中通路影響力大于0.2為主要代謝通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、亞油酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成。對顯著性差異代謝物進(jìn)行單變量ROC曲線分析，進(jìn)一步考察這些顯著性差異代謝物對分類的識別能力，ROC曲線下的面積（AUC）大于0.5時，說明具有較好的識別能力，AUC越接近于1，即ROC曲線越靠近左上角，識別效果越好。本試驗結(jié)果顯示，A組和B組有9個代謝物AUC面積在0.8以上。如圖10。這9個代謝物為：Creatinine：肌酐、5，2'-O-dimethylcytidine：5，2'-O-甲基胞苷、Myristoleic acid：肉豆蔻酸、L-Leucine：亮氨酸、Nicotinate：煙酸、3-Hydroxybenzoate：3-羥基苯甲酸、Hypoxanthine：次黃嘌呤、gamma-L-GlutamNicotinateyl-L-valine：γ-谷 氨 酰 纈 氨 酸、Hippuric acid：馬尿酸。試驗組和對照組相比，9個差異代謝物顯著性上調(diào)。

表3 A組和B組正離子模式下鑒定的差異代謝物

表4 A組和B組負(fù)離子模式下鑒定出的差異代謝物

3 討論

3.1 ?；撬岷蛠喤；撬岽x

?；撬岷蛠喤；撬岽x通路反映了機體的能量代謝水平［20］。牛磺酸具有維護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［21］，可以促進(jìn)肌肉組織對葡萄糖和必需氨基酸的攝取和利用，加速糖酵解，增加糖異生［22］。張瑞等［23］在研究黃芪的抗疲勞作用時，發(fā)現(xiàn)大鼠腓腸肌中代謝物?；撬崴浇档?。這和本研究中圍產(chǎn)前期日糧添加山楂、黃芪后飼喂14 d試驗組奶牛血漿代謝物牛磺酸顯著下調(diào)試驗結(jié)果一致。說明日糧添加山楂、黃芪可能通過加速奶牛血漿代謝物?；撬岬拇x，用于調(diào)控葡萄糖和氨基酸的代謝。

3.2 D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝

谷氨酰胺屬于生糖氨基酸被作為生糖物質(zhì)，是肝糖原發(fā)生異生作用的重要底物，維持和調(diào)節(jié)生物機體的總氨基酸穩(wěn)態(tài)［24］。谷氨酰胺參與調(diào)控葡萄糖代謝過程［25］，增強免疫效應(yīng)［26］。谷氨酰胺和谷氨酸同時參與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝兩個代謝通路。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路中谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，谷氨酰胺被谷氨酰胺磷酸酶水解成谷氨酸，繼續(xù)參與循環(huán)［27-28］。谷氨酸參與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路時，在谷氨酸脫氫酶的作用下被代謝為α-酮戊二酸。參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路時，谷氨酸可生成琥珀酸［29］。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，在三羧酸循環(huán)中為機體提供能量［30］。有研究表明谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)［31］，可以作為中間代謝產(chǎn)物將氨基酸代謝和蛋白質(zhì)代謝連接起來［32］。本研究中在圍產(chǎn)前期日糧添加山楂、黃芪試驗組圍產(chǎn)期奶牛血漿代謝物谷氨酰胺和谷氨酸分別顯著上調(diào)和下調(diào)。造成這種結(jié)果可能是因為谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺增加或谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸減少，增多谷氨酰胺可能用于調(diào)控葡萄糖代謝過程，提高機體蛋白質(zhì)的合成和葡萄糖能量的補充。

圖8 A組和B組差異代謝物聚類熱圖

圖9 A組和B組差異代謝物的代謝通路分析

圖10 十個顯著性差異代謝物的ROC曲線

3.3 纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成

亮氨酸是機體必需氨基酸中的支鏈氨基酸，也是重要的生酮氨基酸［33-34］。Arakawa和 Pleck 等［35-36］研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸在調(diào)控糖脂代謝和免疫功能方面有重要作用。曲婷麗等和王二兵等［37-38］研究發(fā)現(xiàn)黃芪乙酸乙酯萃取物治療小鼠白細(xì)胞減少癥時血清代謝物亮氨酸顯著上調(diào)。這和本研究血漿代謝物亮氨酸顯著上調(diào)的結(jié)果一致。在圍產(chǎn)前期奶牛連續(xù)飼喂14 d山楂、黃芪血漿代謝物亮氨酸上調(diào)，說明日糧添加山楂、黃芪有利于增強產(chǎn)前期奶牛免疫力，維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定。

3.4 亞油酸代謝

亞油酸是組成游離脂肪酸的重要成分［39］。有研究發(fā)現(xiàn)亞油酸能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，引起機體紅細(xì)胞的急性損傷［40］。李秋紅等［41］發(fā)現(xiàn)荷葉黃酮具有良好的清除自由基能力，能有效抑制亞油酸的氧化。有研究認(rèn)為，部分黃酮類化合物具有抗氧化作用［42］，胡博路等［43］研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有很強的抗氧化活性。由此推測黃芪中黃酮類化合物可能是抑制亞油酸氧化的物質(zhì)，減少亞油酸氧化導(dǎo)致奶牛機體細(xì)胞損傷。有研究表明亞油酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長有抑制作用，并且對奶牛乳腺上皮細(xì)胞液中脂質(zhì)小滴的合成有促進(jìn)作用［44］。本研究中在圍產(chǎn)前期奶牛連續(xù)飼喂14 d山楂、黃芪血漿代謝物亞油酸顯著下調(diào)，說明產(chǎn)前奶牛日糧中添加山楂、黃芪有利于乳腺上皮細(xì)胞生長及促進(jìn)脂質(zhì)小滴合成的作用。

4 結(jié)論

本研究中在圍產(chǎn)前期奶牛連續(xù)飼喂14 d山楂、黃芪血漿代謝物中谷氨酰胺和亮氨酸顯著上調(diào)，琥珀酸、?；撬帷⒐劝彼岷蛠営退犸@著下調(diào)，這些物質(zhì)調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期奶牛葡萄糖代謝和氨基酸代謝通路中牛磺酸和亞?；撬岽x、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝和纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，及脂肪酸代謝通路中亞油酸代謝。