蔡泱蓮，黃寬官，黃俊浩，吳 鴻

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

近年來，隨著我國城市規(guī)模的發(fā)展、綠化面積的擴大，蔥蓮Zephyranthes candida又名蔥蘭，在城市綠化中應用越來越廣泛，蔥蘭夜蛾Brithys crini的發(fā)生范圍和危害程度亦隨之增加。蔥蘭夜蛾又名毛健夜蛾、文殊蘭夜蛾，屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae健夜蛾屬Brithys昆蟲，主要為害蔥蓮，朱頂紅Hippeastrum rutilum，石蒜Lycoris radiata，文殊蘭Crinum asiaticumvar.sinicum等石蒜科Amaryllidaceae的植物[1-2]。其主要為害方式為幼蟲蠶食或鉆蛀寄主植物的葉片、花梗、花、莖桿或球根，食量巨大，可將寄主植物地面以上莖葉全部食光。夏季炎熱時，幼蟲早晚取食，白天隱匿；在比較陰潮的林下，幼蟲終日都可以取食為害。該蟲在國內(nèi)主要分布在浙江、江蘇、上海、江西等地，而最早見于印度、緬甸、斯里蘭卡、新加坡、印度尼西亞和日本等國家[3]。

昆蟲腸道微生物的群落結構、代謝活動便會受到宿主昆蟲腸道微生物環(huán)境的影響，微生物通過一系列策略機制來適應昆蟲腸道微環(huán)境，與之形成共生關系，相互影響，相互生存[4]。腸道微生物參與昆蟲的食物消化、為昆蟲提供特殊營養(yǎng)、也可以抵抗外來微生物侵染、降解食物中的有毒物質(zhì)來使昆蟲不受傷害、會合成信息素成分和引起宿主昆蟲免疫反應等[5]。

16S rDNA是原核生物染色體上編碼核糖體RNA的對應DNA序列，包括保守區(qū)和高變區(qū)兩部分，其中保守區(qū)主要可用于確定物種間親緣關系，服務于系統(tǒng)進化研究；而高變區(qū)則更多的反映物種組成和豐度信息，有助于更加全面的對腸道細菌的結構組成、最佳生長條件、腸道細菌多樣性分析和不同功能進行研究[6]。高通量測序可提供大量的有效數(shù)據(jù)，通過對這些數(shù)據(jù)進行分析即可獲得樣品中微生物的多樣性信息，尤其是用高通量測序依賴的16S rRNA測序分析腸道微生物多樣性，包括物種注釋與評估、物種組成分析、β多樣性分析、物種差異分析、進化關系分析和16S功能預測等[7]。

本研究采集浙江農(nóng)林大學校園為害蔥蓮的蔥蘭夜蛾，采用IonS5TMXL高通量測序技術，數(shù)據(jù)分析主要采用Cutadap，UCHIME Algorithm，Uparse，Qiime，LEfSe，R等軟件對蔥蘭夜蛾腸道細菌的多樣性進行初步分析與比較，為進一步研究蔥蘭夜蛾腸道微生物的功能及其在防治中的應用提供理論。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2017年11月21日在浙江省杭州市浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)采集蔥蘭夜蛾4齡幼蟲。單頭幼蟲為1個樣本，共4個重復，分別標記為YE1，YE2，YE3和YE4。

1.2 蔥蘭夜蛾腸道細菌總DNA抽提

采集新鮮蟲體24 h內(nèi)解剖腸道。在超凈工作臺內(nèi)，將蟲體放入無菌水中，清洗表面異物，放入75%酒精浸泡1 min，取出后再放入100%酒精麻醉，瀝干，用鑷子取其腸道。蟲體除腸道外的軀干用于昆蟲物種分子鑒定，腸道則用于后續(xù)細菌多樣性測定。

腸道細菌總DNA采用試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit）提取，提取完的總DNA分裝4份，1份保存于4℃冰箱用于測定DNA質(zhì)量，其余3份保存于-20℃冰箱備用。高通量測序的DNA樣本濃度和質(zhì)量使用Nanodrop分光光度計檢測。

1.3 蔥蘭夜蛾腸道細菌16S rDNA擴增及測序

以1.2節(jié)提取的腸道細菌總DNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序。采用細菌V3-V4區(qū)通用引物對16S rDNA進行 PCR擴增。所用引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。使用 Thermofisher公司的 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的IonS5TMXL進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

使用Cutadapt進行剪切、拆分和處理得到原始序列（Raw reads），并利用UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），同時會選取OTU數(shù)目的代表性序列進行物種注釋。使用Qiime軟件計算Chao1，Shannon和Simpson指數(shù)，使用R軟件繪制稀釋曲線，Rank abundance曲線，物種累積曲線并使用R軟件進行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析等。

2 結果與分析

2.1 蔥蘭夜蛾4個腸道樣品測序結果及取樣深度驗證

測序后，共獲得蔥蘭夜蛾腸道細菌序列273 453條。為了研究樣品的物種組成多樣性，對所有樣品的Clean reads進行聚類，在97%相似度下平均每個樣本可聚類為512個OTU數(shù)目，然后對OTU數(shù)目的代表序列進行物種注釋。

2.2 稀釋曲線（Rarefaction Curve）

稀釋曲線是指從樣品中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計所代表的物種數(shù)目，即OTU數(shù)目，通過抽取的測序數(shù)據(jù)量和對應物種數(shù)來構建曲線。利用稀釋曲線評價蔥蘭夜蛾腸道細菌的測序深度和物種豐富度，雖然隨著測序深度增加，但是稀釋曲線并未達到飽和，這一方面主要由于二代測序能夠檢測到很多低豐度物種，另一方面由于食物帶入腸道的過路細菌以及一些死的細菌均可能引起稀釋曲線很難達到飽和（圖1）。

圖1 蔥蘭夜蛾幼蟲腸道細菌類群的多樣性分析Figure1 Diversity(A)and abundance(B)of intestional bacterial colonies of Brithys crini

2.3 Alpha多樣性分析

對OTU數(shù)目進行Alpha多樣性指數(shù)分析，并對其進行群落結構的統(tǒng)計分析（表1）。Alpha多樣性指對單個樣品中物種多樣性的分析，本研究分析了Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)等。Chao1指數(shù)反映的事樣品中群落豐富度，而Shannon指數(shù)反映樣品群落的多樣性，Simpson指數(shù)反映樣品群落中優(yōu)勢種的集中程度。Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中物種越豐富多樣。

表1 蔥蘭夜蛾中腸道細菌Alpha多樣性分析Table1 Alpha diversity of intestinal bacteria in Brithys crini

蔥蘭夜蛾腸道細菌種類有較高的豐富度和多樣性，其腸道微生物Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為0.93～0.98，5.66～6.82和439.57～584.12。其中樣品YE1的群落豐富度和多樣性最高，群落優(yōu)勢種的集中程度也最大。

根據(jù)Alpha指數(shù)進行作圖分析（以Shannon指數(shù)為例）。Shannon指數(shù)是反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。Shannon曲線中蔥蘭夜蛾4個腸道樣品細菌稀釋曲線均趨于平緩（圖1B），說明測序數(shù)據(jù)量足夠大。起初曲線直線上升，是由于測序條數(shù)遠不足覆蓋樣品導致，數(shù)值升高直至平滑說明測序條數(shù)足以覆蓋樣品中的大部分微生物。YE1的指數(shù)明顯高于其他3個樣本（圖1A），其數(shù)據(jù)可信度有待檢驗。

2.4 蔥蘭夜蛾4個腸道樣品細菌物種相對豐度分析

4個樣本聚類注釋后，平均99.98%的序列被注釋為細菌（表2）。注釋鑒定共獲得23門57綱86目168科347屬。

表2 蔥蘭夜蛾幼蟲腸道4個樣本聚類注釋后細菌與古細菌所占比例Table2 Proportion of bacteria and archaea after cluster annotation of Brithys crini intestinal canal

在門水平上，蔥蘭夜蛾腸道微生物的16S rDNA基因序列共注釋到了變形菌門Proteobacteria，厚壁菌門Firmicutes，擬桿菌門Bacteroidetes，放線菌門Actinobacteria，藍藻門Cyanobacteria，梭桿菌門Fusobacteria，酸桿菌門Acidobacteria，綠彎菌門Chloroflexi，異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus，糖菌門Saccharibacteria等23個門（圖2）。4個樣本的腸道細菌優(yōu)勢菌門均為變形菌門（26.15%～51.97%）和厚壁菌門（15.70%～37.70%），腸道細菌優(yōu)勢門相似，但不同個體樣本的相對豐度有所差異，其中YE2，YE3和YE4的變形菌門含量最豐富，占48.22%～50.55%，其次是厚壁菌門含量較豐富，占15.70%～22.94%；而YE1的厚壁菌門含量（37.70%）比變形菌門（26.15%）高。

圖2 蔥蘭夜蛾幼蟲腸道細菌門的組成和結構Figure2 The proportion of phylum of the intestine intestinal bacteria in of Brithys crini in phylum level

在綱水平上，主要有γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，梭菌綱Clostridia，未分類的放線菌綱unidentified Actinobacteria，擬桿菌綱Bacteroidia，α-變形菌綱Alphaproteobacteria，芽孢桿菌綱Bacilli，葉綠體Chloroplast，β-變形桿菌綱Betaproteobacteria等。占比最高的優(yōu)勢綱為γ-變形菌綱，平均相對豐度為33.85%，其中有梭菌綱（14.84%）、未分類的放線菌綱（11.54%）、擬桿菌綱（8.61%）、α-變形菌綱（8.21%）、芽孢桿菌綱（7.17%）、葉綠體（4.41%）、β-變形桿菌綱（1.51%）等（圖3A）。

在目水平，主要有腸桿菌目Enterobacteriales，梭菌目Clostridiales，擬桿菌目Bacteroidales，芽孢桿菌目Bacillales，根瘤菌目Rhizobiales，微球菌Micrococcales，未識別的葉綠體unidentified_Chloroplast等。平均相對豐度占比前10的是腸桿菌目（30.63%）、梭菌目（14.78%）、擬桿菌目（8.61%）、芽孢桿菌目（4.82%）、根瘤菌目（4.65%）、微球菌（4.28%）、未識別的葉綠體（4.02%）、丙酸桿菌目（3.14%）、乳桿菌目（2.34%）、棒狀桿菌目（1.48%），其中優(yōu)勢目為腸桿菌目，占比達到30.63%（圖3B）。

在科水平，主要有腸桿菌科Enterobacteriaceae，毛螺菌科Lachnospiraceae，桿菌科Bacillaceae，未識別的葉綠體unidentified_Chloroplast，反芻球菌科Ruminococcaceae，柏科Prevotellaceae，擬桿菌科Bacteroidaceae等，以及許多未鑒定科。平均相對豐度占比前10的科分別是腸桿菌科（30.63%）、毛螺菌科（9.34%）、桿菌科（4.02%）、未分類的葉綠體（4.02%）、反芻球菌科（3.42%）、柏科（3.39%）、擬桿菌科（3.03%）、微絲菌科（2.73%）、丙酸桿菌科（2.50%）、甲桿菌科（2.36%），其中腸桿菌科所占比例最高達到30.63%（圖3C）。

圖3 蔥蘭夜蛾幼蟲腸道細菌在不同分類等級上的物種比例Figure3 The proportions of class,order,family and genus the of intestinal bacteria species in the intestine of larval Brithys crini at different classification level

在屬水平，主要有克雷伯氏菌屬Klebsiella，泛菌屬Pantoea，Tyzzerella_3，未識別的葉綠體unidentified Chloroplast，擬桿菌屬Bacteroides，普雷沃菌屬Prevotella，丙酸桿菌屬Propionibacterium，甲醇桿菌屬Methylobacterium，腸桿菌屬Enterobacter，根瘤菌Rhizobium等，以及許多未鑒定屬。平均相對豐度占比前10的為克雷伯氏菌屬（13.61%）、泛菌屬（6.99%）、未命名的屬Tyzzerella_3（6.10%）、未分類的葉綠體（4.02%）、擬桿菌屬（3.03%）、普雷沃菌屬（2.64%）、丙酸桿菌屬（2.38%）、甲醇桿菌屬（2.30%）、腸桿菌屬（1.91%）、根瘤菌屬（1.19%），其中克雷伯氏菌屬所占比例最高達到13.61%，（圖3D）。

本研究共注釋獲得347個屬，相對于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術，IonS5TMXL技術可以全面地檢測到樣本中的細菌，然而其中大多數(shù)是未鑒定菌和未命名菌。前20個明確鑒定到屬的類群，相對豐度都較低（表3），但是在腸道中的作用卻不可輕視。其中，克雷伯氏菌屬含量最豐富，鞘脂單胞菌屬和葉桿菌屬的含量在4個個體間表現(xiàn)出較大差異但是每個樣本中都占有一定的比例。

表3 屬水平上豐度排名前20的蔥蘭夜蛾幼蟲腸道菌群Table3 The top 20 abundant genera of intestinal bacteria in Brithys crini

3 結論與討論

近年來，隨著基于16S rDNA的高通量測序技術的發(fā)展和應用，昆蟲腸道微生物群落結構的研究迎來了一個嶄新的黃金時期。16S rRNA測序技術可以避開微生物分離培養(yǎng)的過程，能夠準確、快速、高通量地解讀微生物群體的多樣性與豐度[8]。本研究采用16S rDNA和IonS5TMXL技術首次開展蔥蘭夜蛾幼蟲腸道細菌菌落組成分析，共注釋鑒定23門57綱86目168科347屬。

在23門中，含量最高的為變形菌門，該結果與有些昆蟲腸道中的優(yōu)勢菌相同。如豌豆蚜Acyrthosiphon pisum[9]，點蜂緣蝽象Riptortus clavatus[10]，澤蘭實蠅Procecidochares utilis[11]，地中海實蠅Ceratitis capitate，柑橘大實蠅Bactrocera minax[12]，沙蠅Lutzomyia longipalpis[13]，沙漠蝗Schistocerca gregaria[14]，天牛Saperdave stita[15]以及茶尺蠖Ectropis obliqua[16]等昆蟲腸道中鑒定獲得的優(yōu)勢菌均為變形菌門。

Yun等[17]對大量不同種昆蟲的腸道菌群多樣性的研究表明，昆蟲腸道中的優(yōu)勢菌群主要隸屬于變形菌門和厚壁菌門，這與本研究結果大體一致。然而蔥蘭夜蛾腸道的優(yōu)勢菌群與有些昆蟲腸道中不同，家蠅Musca domestica腸道的優(yōu)勢菌還有擬桿菌門[18]，而白蟻Reticulitermes speratus腸道優(yōu)勢菌依次為擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋體門、變形菌門[19]。鞘翅目昆蟲五月鰓金龜Melolontha melolonth的腸道優(yōu)勢菌為厚壁菌門[20]。昆蟲腸道微生物的多樣性除了與昆蟲種類有關外，還與食物及環(huán)境因素相關[17]。因此，尚需進一步研究來自不同生育期和不同地理種群的蔥蘭夜蛾幼蟲的腸道微生物多樣性，更全面地明確蔥蘭夜蛾幼蟲腸道細菌的多樣性。

在蔥蘭夜蛾幼蟲腸道347屬細菌中，克雷伯氏菌屬為優(yōu)勢屬，占13.6%，這與已報道的柑橘大實蠅結果一致[13]。蔥蘭夜蛾與地中海實蠅腸道細菌優(yōu)勢屬的結果不太相同，其主要有克雷伯氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬、果膠桿菌屬Pectobacterium和檸檬酸桿菌屬Citrobacter[21]。這些不同豐度的屬是否具有不同功能值得繼續(xù)關注和研究，且為進一步探索利用蔥蘭夜蛾共生微生物資源進行害蟲防治奠定了基礎。

蔥蘭夜蛾幼蟲腸道中還發(fā)現(xiàn)了一部分人類腸道常見菌群，包括擬桿菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬。其中，擬桿菌屬在蔥蘭夜蛾幼蟲腸道中的平均相對豐度達到3.03%，它一般寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道[22]。腸桿菌屬可能參與編碼一系列纖維素和木質(zhì)素降解酶[23]，在河曲絲葉蜂Nematus hequensi中發(fā)現(xiàn)可能有助于宿主昆蟲的生殖發(fā)育和碳氮代謝[24]，在乳黃家白蟻Coptoermes lacteus中發(fā)現(xiàn)了與昆蟲營養(yǎng)消化有關的具固氮活性的成團腸桿菌Enterbacter agglomerans[25]；泛菌屬也可從動物和人的傷口、血和尿中分離到，是人類條件致病菌[26]。另外還發(fā)現(xiàn)在其他昆蟲中具有纖維素水解和果膠水解活性的根瘤菌屬和沙雷氏菌屬，這兩類菌都是河曲絲葉蜂幼蟲腸道的優(yōu)勢菌群，有助于合成食物所缺乏的含氮化合物，并對萜烯化合物具解毒功能[27-28]。進一步研究和驗證上述功能菌是否在蔥蘭夜蛾腸道具有類似功能，能為蔥蘭夜蛾的防治帶來新途徑。

研究昆蟲腸道微生物有利于深入了解其系統(tǒng)發(fā)育及與宿主協(xié)同進化關系，為闡述昆蟲的適應性、多樣性以及與共生微生物協(xié)同進化機制奠定理論基礎[29]。本研究全面分析了蔥蘭夜蛾體內(nèi)微生物群落結構及多樣性，極大豐富了蔥蘭夜蛾體內(nèi)微生物相關信息，有助于蔥蘭夜蛾體內(nèi)關鍵微生物種類的挖掘及其生物學功能的解析，為基于腸道微生物開發(fā)新的綠色防治技術奠定基礎。