曾繁森, 葉妍琦, 張美清, 鄭詩鈺, 李 潔, 費 鵬*

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000）

紫薯（Purple Potato），又名黑薯、苕薯，是旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea）.除具有普通紅薯的營養(yǎng)成分以外，還富含硒元素和花色苷，是提取制備花色苷的主要原料之一，在日本國家蔬菜癌癥研究中心公布的抗癌蔬菜中名列榜首.紫薯色澤美觀，營養(yǎng)豐富，從莖尖嫩葉到薯塊都有一定的保健功能.不僅如此，紫薯還含有豐富的花色苷.花色苷是自然界最重要的水溶性的色素之一，其是通過糖苷鍵將花青素與糖苷連接起來的黃酮類化合物，廣泛存在于植物體的根、莖、葉、花、果實之中，具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗腫瘤、抑制肥胖、調(diào)節(jié)血脂平衡、抑制膽固醇等多種生物活性[1].

天然植物中的花色苷種類有很多，形貌、性質(zhì)等各有不同，但大多數(shù)花色苷均可以根據(jù)環(huán)境中的酸堿情況形成不同的構(gòu)型，發(fā)生不同的顯色反應(yīng).食品的腐壞變質(zhì)會伴隨胺、氨等揮發(fā)性含氮化合物的產(chǎn)生，從而造成pH 環(huán)境的改變[2].因此，根據(jù)花色苷顏色隨著環(huán)境pH 值變化而變化這一特性，可將其作為食品保鮮膜的氣敏材料，反映食品的新鮮程度.另外，花色苷存在廣泛，提取容易，是理想的抗氧化、抑菌添加劑[3].作為天然的抗氧化添加劑，不像合成的抗氧化劑那樣受到人們的質(zhì)疑.將其添加到食品保鮮膜中，會從保鮮膜中緩慢擴(kuò)散到所包裹食品的表面甚至是內(nèi)部，阻止食品內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的氧化，延長食品的保質(zhì)期.

實驗采用浸提法提取紫薯中的花色苷， 研究其對pH 值的響應(yīng)； 以Vc 為對照， 研究紫薯花色苷對DPPH、OH 自由基的清除效果；以及溫度、pH 值、光照對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響.通過這幾項測試結(jié)果能夠分析紫薯花色苷作為添加劑加入氣敏性食品保鮮膜的可行性，為紫薯花色苷在氣敏性食品保鮮膜的應(yīng)用和開發(fā)提供參考和借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料與試劑見表1.

表1 實驗所用主要試劑Tab.1 Reagents used in the experiment

1.2 設(shè)備與儀器

設(shè)備與儀器見表2.

表2 實驗所用主要儀器設(shè)備Tab.2 Instruments and equipment used in the experiment

1.3 實驗方法

1.3.1 紫薯花色苷的提取

將紫薯烘干、粉碎后，過40 目篩得到干粉狀原料，置于棕色瓶避光保存.將2% (w/v)的乙酸水溶液和無水乙醇以體積比1∶1 混合作為浸提劑，并與原料按照料液比1∶15 g/mL 混合，超聲處理30 min，再于水浴鍋中在50 ℃條件下浸提90 min， 取出后經(jīng)過抽濾得到色素浸提液.再將色素浸提液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液經(jīng)冷凍干燥去除浸提劑，得到花色苷粉末并冷藏避光保存?zhèn)溆?

1.3.2 花色苷含量測定

使用pH 示差法測定花色苷含量，參照國標(biāo)GB1886.244-2016.

按照公式(1)計算花青素含量.

吸光度值，A=(A526nm-A700nm)pH1.0-(A526nm-A700nm)pH4.5；MW 為矢車菊色素-3-葡萄糖苷 （Cyanidin-3-O-glucoside）的相對分子量(449.2 g/mol)；ε 為摩爾消光系數(shù)（26 900 L·mol-1·cm-1）, DF 為稀釋因子（V/Wt）.

1.3.3 紫薯花色苷對pH 值的響應(yīng)

分別配制pH 值為1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 ,11.0 ,12.0,13.0 的緩沖溶液；取13 份4 mL 花色苷濃縮液，用上述緩沖溶液分別定容至25 mL，并通過全波長酶標(biāo)儀作全波長掃描，探討花色苷提取物的吸光特性對pH 值響應(yīng)；

1.3.4 花色苷的抗氧化性測定

1）DPPH 自由基清除率測定

配制0.25 mmol/L DPPH 溶液和50 mg/L 維生素C 溶液， 然后取10 mL 花色苷濃縮液， 定容至100 mL；分別取 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 和 1.0 mL 的花色苷濃縮液及維生素 C 溶液，分別加入到 4 mL DPPH 溶液中， 黑暗中靜置 30 min， 以相應(yīng)濃度的花色苷濃縮液和維生素C 溶液為空白對照，測試紫外-可見全掃描光譜，按公式(2)計算DPPH 自由基清除率.

其中，An為樣品測得的最大吸光度，A0為參照測得的相應(yīng)吸光度.

2）羥基自由基清除率測定

分別配制2 mmol/L 的FeSO4，2 mmol/L 的H2O2溶液，2 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液和1 g/L 維生素C溶液；取10 ml 花色苷濃縮液，定容至100 mL；分別取3 mL FeSO4和 3 mL 水楊酸加入到10 mL 離心管中，混合均勻；分別取 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 和 1.0 mL 的花色苷濃縮液加入到上述離心管中；將離心管置于37 ℃水浴中加熱30 min，以相應(yīng)濃度的花色苷濃縮液和維生素C 溶液為空白對照，測試紫外-可見全掃描光譜，按公式(3)計算OH 自由基清除率.

其中，An為樣品測得的最大吸光度，A0為參照測得的相應(yīng)吸光度.

1.3.5 紫薯花色苷的穩(wěn)定性研究

取9 份 5 mL 花色苷濃縮液，稀釋至 25 mL，分別將其置于不同溫度下（4 ℃、25 ℃、40 ℃），不同 pH（4、7、10）以及不同光照環(huán)境（紫外光、光照、黑暗）下儲藏5 d，每天對其作紫外可見全掃描，分析其在不同環(huán)境下的降解狀況.

1.3.6 花青素提取物的分子基團(tuán)及表觀形貌分析

通過IS10 型全反射紅外光譜（ATR-FTIR）表征紫薯花色苷的表面基團(tuán)，波數(shù)范圍4 000-400 cm-1，掃描次數(shù)64 次，分辨率4 cm-1；使用掃描電鏡（SEM）在合適視野中采集紫薯花色苷粗提物的微觀圖像，研究其表觀形貌，加速電壓為10 kV.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫薯花色苷的含量

本次實驗采用pH 示差法檢測了樣品中總花色苷的含量，檢測結(jié)果如圖1 所示，代入公式(1)可得此次所得花色苷濃縮液中花色苷含量為25.64 mg/L，通過冷凍干燥將花色苷濃縮液干燥成粉末樣，其粗提物中花色苷含量為0.29 mg/g.

圖1 紫薯花色苷在pH 1.0 及pH 4.5 時可見光區(qū)全波段光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of purple potato anthocyanin at pH 1.0 and pH 4.5

2.2 紫薯花色苷顏色對pH 值的響應(yīng)

如圖2 所示，圖中吸收峰波長發(fā)生了四次明顯變化，分別對應(yīng)了不同pH 下花色苷四種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變：從pH1.0-4.0 時，最大吸收峰位置出現(xiàn)在520 nm 左右，這是由于花色苷以紅色的花色烊陽離子形式存在導(dǎo)致的；隨著pH 值的不斷增大，其在520 nm 處的吸收峰強度逐漸降低，這是由于花色烊陽離子結(jié)構(gòu)的減少且逐漸轉(zhuǎn)化為無色的甲醇假堿和查爾酮假堿導(dǎo)致的；當(dāng)pH 值上升至7.0 時，花色烊陽離子結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，花色苷最大吸收波長發(fā)生紅移（圖2B）；當(dāng)pH 達(dá)到8.0 時，溶液成明顯的藍(lán)綠色，花色苷最大吸收波長為618 nm，這是由于花色苷結(jié)構(gòu)開始轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色醌式結(jié)構(gòu)造成的，且隨著pH 值繼續(xù)上升，藍(lán)綠色不斷加深，最大吸光度隨之上升（圖2C）；當(dāng)pH 值繼續(xù)上升至11.0-13.0 時，溶液逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，最大吸收波長仍然在618 nm 處，但吸光度逐漸降低，這是由于在強堿環(huán)境下，花色苷的藍(lán)色醌式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，形成共振穩(wěn)定的醌式陰離子造成的[4].

圖2 不同pH 值下紫薯花色苷的可見光區(qū)全波段光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectra of purple potato anthocyanin at different pH value

2.3 紫薯花色苷的自由基清除能力

在食品中，過多的自由基會削弱細(xì)胞的抵抗力，產(chǎn)生破壞細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì).這會使細(xì)胞膜喪失保護(hù)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致食品更易受到微生物的感染，使食品更易腐敗，產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)[5].而紫薯花色苷具有較強的還原性，可以清除環(huán)境中氧自由基[6].

2.3.1 紫薯花色苷的DPPH 自由基清除率

在該實驗中所采用的紫薯花色苷和Vc 濃度分別為2.56 mg/L、50.00 mg/L， 不同添加量紫薯花色苷和Vc 溶液對DPPH·的清除能力如圖3 所示.實驗發(fā)現(xiàn)，在清除劑加入的1 min 內(nèi)，溶液顏色即隨清除劑添加量增加而逐漸變淺.由圖3 可知，DPPH 自由基清除率隨著紫薯花色苷和Vc 溶液添加量的增加而增加， 計算可得紫薯花色苷和Vc 對DPPH 自由基清除率的IC50值分別是0.23 mg/L 和6.07 mg/L.由此可知，紫薯花色苷的DPPH·清除能力遠(yuǎn)高于Vc，且在所選添加量范圍內(nèi)，隨著花色苷濃度增加，清除能力能夠繼續(xù)提高到80 %以上.

圖3 紫薯花色苷(A, C)與Vc (B, D)的DPPH 自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of purple potato anthocyanin (A, C) and Vc (B, D)

2.3.2 紫薯花色苷的羥基自由基清除率

在該實驗中所采用的紫薯花色苷和Vc 濃度分別為2.56 mg/L、1 g/L.不同添加量的紫薯花色苷溶液和Vc 溶液對OH 自由基清除率如圖4 所示.實驗發(fā)現(xiàn)，在清除劑加入的1 min 內(nèi)，溶液顏色即隨清除劑添加量的增加而逐漸變淺.由圖可知，·OH 清除率隨著紫薯花色苷溶液和Vc 溶液添加量的增加而增加，通過計算可得紫薯花色苷和Vc 對·OH 清除率的IC50 值分別是0.384 mg/L 和106.3 mg/L.因此可知，紫薯花色苷溶液的·OH 清除能力遠(yuǎn)高于Vc.

圖4 紫薯花色苷(A, C)與Vc (B, D)的·OH 自由基清除率Fig.4·OH radical scavenging rate of purple potato anthocyanin (A, C) and Vc (B, D)

2.4 不同貯藏條件下紫薯花色苷的穩(wěn)定性

由上文可知，紫薯花色苷有很強的還原能力，暴露在空氣中易發(fā)生氧化降解.而若要作為食品保鮮膜的成分，必須有一定耐儲能力.因此有必要對紫薯花色苷的穩(wěn)定性進(jìn)行評價.

分別選取了不同溫度、pH 值、光照條件為測試條件，對紫薯花色苷的穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

如圖5A 所示，相同濃度、pH 值的紫薯花色苷溶液在不同溫度下隨保存時間的增加，發(fā)生了不同程度的降解.同時，溫度越高，其降解越快.但是總體來說，紫薯花色苷的穩(wěn)定性較好，在4 ℃下儲藏5 天，其降解率僅為3.1 %，即便儲藏溫度上升至40 ℃，紫薯花色苷的5 天降解率也僅為7.9 %.

如圖5B 所示，紫薯花色苷在pH 4 下儲存時，其降解率最低，僅為2.03 %（5 天）.當(dāng)pH 值增大時，其降解率不斷升高：在pH 10 下儲藏5 天時，紫薯花色苷降解率達(dá)到7.95 %.這是由于在堿性條件下，紫薯花色苷主要以醌式結(jié)構(gòu)存在，而醌式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會形成共振穩(wěn)定的醌式陰離子.由此可知，紫薯花色苷在酸性條件下穩(wěn)定性較差.

由圖5C 可以看出紫薯花色苷溶液在紫外光照條件下， 花色苷降解率較大， 在第5 天時降解率達(dá)到15.92 %.而在有光照和避光條件下，花色苷降解率較紫外光照射下變化不顯著，降解率分別為6.25 %和4.79 %.光是植物合成花色苷的條件之一，但光同時也會加快花色苷的降解[7].強光使花色苷2、4 位碳原子活性增強，更易受到親水攻擊而加快降解速率[8].

圖5 不同條件下花色苷降解率變化(A:溫度,B:pH 值,C:光照)Fig.5 Changes of purple potato anthocyanin degradation rate under Different Conditions（A:temperature,B:pH value,C: light levels）

2.5 紫薯花色苷粗提物的分子基團(tuán)及表觀形貌

如圖6A 所示紫薯花色苷的紅外譜圖在3 306 cm-1處有寬而強的吸收峰， 這正是由于紫薯花色苷結(jié)構(gòu)中的芳環(huán)與其環(huán)上多個糖基上的眾多羥基的伸縮振動導(dǎo)致的；在2 983 cm-1處有一吸收峰，是由于與糖基相連的甲基、 亞甲基的伸縮振動引起的.紫薯花色苷在1 644 cm-1處的弱峰為酰胺的伸縮振動特征峰，有研究表明酰胺化程度越高，花色苷越穩(wěn)定[9].而1 459，1 414 cm-1處則對應(yīng)了花色苷苯并吡楠的芳環(huán)和雜環(huán)的骨架振動.1 383，1 279，1 083 cm-1處的一系列吸收峰對應(yīng)了紫薯花色苷糖環(huán)上碳氧鍵的伸縮振動.因此，初步判斷紫薯花色苷由于其結(jié)構(gòu)的酰胺化，而增強了其穩(wěn)定性，所以其能在不同條件下穩(wěn)定保存.由圖6B 可以看出，當(dāng)紫薯花色苷粗提物干燥成粉末時，呈現(xiàn)粗糙不平的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，這可能是由于紫薯花色苷粗提物中富含的大量多糖交聯(lián)形成的，這種結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)花色素分子，阻止其分子的分解，進(jìn)一步提高花色苷的穩(wěn)定性[10].

圖6 紫薯花色苷粗提物的紅外光譜及其表觀形貌Fig.6 Infrared spectra and apparent morphology of purple potato anthocyanin

3 結(jié)論

本實驗以浸提法提取紫薯花色苷，其粗提物的花色苷含量為0.29 g /g；對紫薯花色苷進(jìn)行自由基清除能力實驗，以Vc 為對照，通過比較試樣的吸光度，發(fā)現(xiàn)花色苷清除DPPH 及·OH 自由基能力均強于同質(zhì)量濃度的Vc，證明其具有較好的抗氧化性能；以溫度、pH 值、光照為條件對紫薯花色苷進(jìn)行了穩(wěn)定性的測試，發(fā)現(xiàn)紫薯花色苷對光熱敏感，在酸性條件下穩(wěn)定性較高；實驗最后通過紅外光譜和掃描電鏡對紫薯花色苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)組成和表觀形貌分析，發(fā)現(xiàn)紫薯花色苷有一定的酰胺化及多糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這兩種結(jié)構(gòu)共同起到保護(hù)紫薯花色苷，阻止其分解的作用，增強其穩(wěn)定性.

因此，紫薯花色苷作為天然色素，來源豐富，安全性系數(shù)高，擁有較好的抗氧化能力.能夠起到防止食品腐敗變質(zhì)，延長其保質(zhì)期的作用.同時，紫薯花色苷能夠根據(jù)外界pH 值變化而改變顏色，其處于日常生活條件下的穩(wěn)定性也較好，是氣敏性食品保鮮膜的理想原料.有望將其應(yīng)用于氣敏性食品保鮮膜中，起到食品保鮮和新鮮度檢測的作用，在食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用.