韓偉佳， 吳 橋， 丁 美， 張曉慧， 劉 霜， 陳 煜， 段鐘平

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心 肝衰竭與人工肝治療研究 北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)是指因服用常規(guī)劑量或過(guò)量劑量藥物，導(dǎo)致藥物本身或其代謝產(chǎn)物引起的直接肝損傷，或是人體對(duì)藥物和/或代謝成分產(chǎn)生過(guò)敏或特異質(zhì)反應(yīng)而導(dǎo)致的肝損傷，常引起生化指標(biāo)的異常，嚴(yán)重者甚至最終進(jìn)展成肝硬化和肝壞死[1]。使用肝毒性的藥物治療期間需密切監(jiān)測(cè)肝功生化指標(biāo)，必要時(shí)需停藥并加用保肝藥物，是預(yù)防DILI的重要策略之一[2]。

在保肝藥物選擇方面，中醫(yī)藥是對(duì)傳統(tǒng)中藥湯劑的繼承和創(chuàng)新，在疾病治療過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。肝爽顆粒是保定步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn)的中成藥新藥，主要功能為舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護(hù)肝、軟堅(jiān)散結(jié)，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝功能損傷[3-4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，在肝爽顆粒中，主要發(fā)揮作用的成分為柚皮苷。

在分子生物學(xué)方面，DILI的發(fā)生常與細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)的功能密切相關(guān)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可以降低CYP450酶的活性[7-8]。據(jù)此，我們推測(cè)肝爽顆粒主要成分柚皮苷可通過(guò)抑制CYP450家族基因的表達(dá)預(yù)防DILI的發(fā)生。藥物通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)第一階段代謝酶進(jìn)行氧化反應(yīng)，再通過(guò)第二階段代謝酶進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。藥物經(jīng)過(guò)每一個(gè)階段的代謝酶作用所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物都具有肝毒性，主要表現(xiàn)為激活活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、線粒體和細(xì)胞核損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在第一階段，CYP450是最主要的代謝酶。所以，降低CYP450酶的表達(dá)是減輕藥物損傷的一個(gè)重要方式(見(jiàn)圖1)。為此，本研究在7702細(xì)胞中觀察肝爽顆粒的主要成分柚皮苷是否對(duì)已知的公認(rèn)的具有肝毒性的藥物曲格列酮[9]和雙氯芬酸鈉[10]具有對(duì)抗作用，如果有，機(jī)制是否為降低CYP450系列酶的活性，期待為預(yù)防DILI提供新的思路。

圖1 DILI的機(jī)制 Fig 1 The mechanism of DILI

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源正常人肝細(xì)胞株HL-7702細(xì)胞保存于北京市肝衰竭與人工肝治療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品制備將曲格列酮溶解于0.1%的二甲亞礬(DMSO)中配置成100 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中；將雙氯芬酸鈉溶解于0.1%的DMSO中配置成400 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中；將柚皮苷配置成20 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中。

1.3 主要試劑和儀器Cell Counting Kit-8(CCK8)購(gòu)自DojinDo東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；SYBRTMPremix Ex TaqTM、SuperScript Ⅲ Platinum Twostep 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)試劑盒和總RNA提取試劑Trizol均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；曲格列酮、雙氯芬酸鈉均購(gòu)自美國(guó)MCE公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、雙抗(含青霉素、鏈霉素)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。主要儀器：酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；96孔板、24孔板購(gòu)自德國(guó)Corning公司；Applied BiosystemsTMPCR熱循環(huán)儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞于質(zhì)量濃度為100 g/L FBS、10 g/L雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L EDTA-胰蛋白酶消化傳代。(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組、不同濃度曲格列酮組、1 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組、10 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組、100 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組；正常對(duì)照組、不同濃度雙氯芬酸鈉組、1 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組、10 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組、100 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組。(2)接種于24孔板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組、1 μmol/L柚皮苷組、10 μmol/L柚皮苷組、100 μmol/L柚皮苷組。(3)接種于24孔板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。細(xì)胞分組a：正常對(duì)照組、100 μmol/L曲格列酮組、1 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組、10 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組、100 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組；細(xì)胞分組b：正常對(duì)照組、500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、1 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、10 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、100 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組。

1.5 標(biāo)本收集及檢測(cè)收集96孔板上清用于乳酸脫氫酶(LDH)水平檢測(cè)。分別用Trizol刮取培養(yǎng)板底部細(xì)胞放入1.5 ml EP管中，-80 ℃凍存，以備之后的qRT-PCR檢測(cè)。將上清培養(yǎng)基放入1.5 ml EP管中，-20 ℃儲(chǔ)存，以備血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)送檢。

1.6 CCK8檢測(cè)棄各個(gè)分組的96孔板的上清，加入質(zhì)量濃度為100 g/L CCK8的培養(yǎng)基100 μl，孵育30 min后，酶標(biāo)儀中檢測(cè)吸光度值，波長(zhǎng)為450 nm。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)Trizol試劑提取HL-7702細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)cDNA，以此為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增片段，按SYBR Premis EX Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書加樣，用iQ5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。所檢測(cè)引物見(jiàn)表1，反應(yīng)條件: 50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 0.15 s，60 ℃ 0.3 s， 44個(gè)循環(huán)；55 ℃ 4 s，41個(gè)循環(huán)(見(jiàn)表1)。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷減輕藥物肝細(xì)胞毒性的作用加入柚皮苷后，藥物所致細(xì)胞毒性得到明顯改善，100 μmol/L柚皮苷+曲格列酮組的IC50較曲格列酮組明顯升高(351 μmol/Lvs126 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=197 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=164 μmol/L)對(duì)曲格列酮所致DILI改善不明顯。同樣，100 μmol/L柚皮苷+雙氯芬酸鈉組的IC50較雙氯芬酸鈉組明顯升高(39 883 μmol/Lvs724 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=1 563 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=719 μmol/L)對(duì)雙氯芬酸鈉所致DILI改變不明顯。LDH方面，100 μmol/L柚皮苷對(duì)曲格列酮所致DILI明顯降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改變不明顯。同樣，100 μmol/L柚皮苷對(duì)雙氯芬酸鈉所致DILI明顯降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改變不明顯(見(jiàn)圖2)。

表1 qRT-PCR所檢測(cè)引物Tab 1 Primers detected by qRT-PCR

2.2 柚皮苷降低轉(zhuǎn)氨酶的作用根據(jù)上一步結(jié)果，分別選取曲格列酮100 μmol/L和雙氯芬酸鈉500 μmol/L制造DILI模型，在加入柚皮苷后，DILI HL-7702細(xì)胞的AST、ALT明顯降低(見(jiàn)圖3)。其中1 μmol/L柚皮苷的保護(hù)作用不明顯(P>0.05)，而10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷的保護(hù)作用明顯(P<0.05)(見(jiàn)表2～3)。

2.3 柚皮苷減輕凋亡的作用加入柚皮苷后，曲格列酮、雙氯芬酸鈉所致肝毒性HL-7702細(xì)胞的Caspase3基因表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖4)。1 μmol/L柚皮苷組、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表2 不同濃度柚皮苷在降低曲格列酮所致HL-7702細(xì)胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用Tab 2 The effect of naringin on the transaminase induced by Tragllitazone

注：*:與曲格列酮組比較。

圖2 柚皮苷減輕藥物肝毒性的作用A：不同濃度柚皮苷在減輕不同濃度曲格列酮所致HL-7702細(xì)胞的肝毒性中的作用；B：不同濃度柚皮苷在減輕不同濃度雙氯芬酸鈉所致HL-7702細(xì)胞的肝毒性中的作用；C：不同濃度柚皮苷在降低不同濃度曲格列酮所致HL-7702細(xì)胞的LDH的作用；D：不同濃度柚皮苷在降低不同濃度雙氯芬酸鈉所致HL-7702細(xì)胞的LDH的作用

Fig 2 The role of naringin in reducing DILIA： the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; B: the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium; C: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; D: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium

表3 不同濃度柚皮苷在降低雙氯芬酸鈉所致HL-7702細(xì)胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用Tab 3 The effect of naringin on the transaminase induced by Diclofenac sodium

注：*:與雙氯芬酸鈉組比較。

2.4 柚皮苷對(duì)于代謝酶基因表達(dá)的改變選取與曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關(guān)的CYP代謝酶基因表達(dá)，分別檢測(cè)1 μmol/L柚皮苷、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷對(duì)CYP基因表達(dá)的改變。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，柚皮苷濃度越高，CYP基因改變?cè)矫黠@(見(jiàn)圖5、表5)。1 μmol/L柚皮苷對(duì)CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP2B6等基因改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，10 μmol/L柚皮苷對(duì)CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7等基因表達(dá)的改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但100 μmol/L柚皮苷對(duì)所有CYP基因表達(dá)的改變差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

肝臟是人體最大的解毒器官，絕大多數(shù)藥物都具有肝臟毒性，目前根據(jù)DILI發(fā)病機(jī)制的概括總結(jié)，藥物經(jīng)磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，在CYP450系酶的消化代謝后，所產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝產(chǎn)物(reactive metabolite)會(huì)激活ROS、異常自身免疫調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體、細(xì)胞核損傷，繼而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，降低CYP酶功能，可作為預(yù)防DILI發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6,11-12]。

圖3 不同濃度柚皮苷在降低不同藥物所致HL-7702細(xì)胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用 A、B:曲格列酮;C、D:雙氯芬酸鈉 Fig 3 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugs A-B: Tragllitazone; C-D: Diclofenac sodium

圖4 不同濃度柚皮苷在降低曲格列酮所致肝毒性HL-7702細(xì)胞的Caspace 3的作用A:曲格列酮;B:雙氯芬酸鈉；

Fig 4 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugsA: Tragllitazone; B: Diclofenac sodium；

圖5 不同濃度柚皮苷對(duì)曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關(guān)CYP基因表達(dá)的改變的檢測(cè)

Fig 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

表4 不同濃度柚皮苷對(duì)降低藥物所致肝毒性HL-7702細(xì)胞Caspase3基因表達(dá)改變的檢測(cè)Tab 4 The effect of naringin on the Caspase3 gene expression induced by drugs

注：*:與曲格列酮組比較；△ ：與雙氯芬酸鈉組比較。

對(duì)乙酰氨基酚是引起DILI最主要的藥物，對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚所引起DILI的機(jī)制與防治已有相對(duì)全面的研究[13-14]。但除去對(duì)乙酰氨基酚，還有很多具有肝毒性的藥物，如曲格列酮、雙氯芬酸鈉等[15-16]，期待更多的機(jī)制研究與預(yù)防措施的出現(xiàn)。

近年，中醫(yī)藥在預(yù)防以及治療慢性疾病方面逐漸在國(guó)內(nèi)和國(guó)際獲得認(rèn)可[17]，在肝病領(lǐng)域，中成藥，如肝爽顆粒，已被證實(shí)在治療慢乙肝、肝硬化以及延緩肝病進(jìn)程方面均可發(fā)揮重要的作用[5,18-19]。而有研究發(fā)現(xiàn)，作為肝爽顆粒主要成分的柚皮苷，在抑制CYP450家族基因表達(dá)方面可發(fā)揮重要作用[7-8]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能夠通過(guò)抑制ROS系統(tǒng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而抑制對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷[20]。但是對(duì)于更多的導(dǎo)致DILI的藥物，柚皮苷是否同樣能夠發(fā)揮保護(hù)作用？這種保護(hù)作用是否與其抑制CYP450家族基因表達(dá)有關(guān)？

本研究結(jié)果顯示，柚皮苷能夠減輕曲格列酮和雙氯芬酸鈉所致DILI的損傷，具有降低轉(zhuǎn)氨酶、減少細(xì)胞凋亡的作用。但這種改善具有劑量依賴性，其中100 μmol/L柚皮苷的保護(hù)作用最明顯，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的保護(hù)作用不明顯。比較CYP代謝酶基因改變情況發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L柚皮苷能夠明顯抑制其表達(dá)，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的抑制作用不明顯。

綜上，肝爽顆粒主要成分柚皮苷能夠通過(guò)抑制CYP酶的功能，從而起到預(yù)防DILI的作用，本次研究期待為臨床用藥提供依據(jù)，也為中藥復(fù)方制劑和單體的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)提供線索。

表5 不同濃度柚皮苷對(duì)曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關(guān)CYP基因表達(dá)的改變的檢測(cè)Tab 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

注：*:與正常對(duì)照組比較。