韓偉佳， 吳 橋， 丁 美， 張曉慧， 劉 霜， 陳 煜， 段鐘平

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心 肝衰竭與人工肝治療研究 北京市重點實驗室，北京100069

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)是指因服用常規(guī)劑量或過量劑量藥物，導致藥物本身或其代謝產(chǎn)物引起的直接肝損傷，或是人體對藥物和/或代謝成分產(chǎn)生過敏或特異質(zhì)反應而導致的肝損傷，常引起生化指標的異常，嚴重者甚至最終進展成肝硬化和肝壞死[1]。使用肝毒性的藥物治療期間需密切監(jiān)測肝功生化指標，必要時需停藥并加用保肝藥物，是預防DILI的重要策略之一[2]。

在保肝藥物選擇方面，中醫(yī)藥是對傳統(tǒng)中藥湯劑的繼承和創(chuàng)新，在疾病治療過程中發(fā)揮了重要作用。肝爽顆粒是保定步長制藥有限公司生產(chǎn)的中成藥新藥，主要功能為舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護肝、軟堅散結(jié)，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝功能損傷[3-4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，在肝爽顆粒中，主要發(fā)揮作用的成分為柚皮苷。

在分子生物學方面，DILI的發(fā)生常與細胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)的功能密切相關[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可以降低CYP450酶的活性[7-8]。據(jù)此，我們推測肝爽顆粒主要成分柚皮苷可通過抑制CYP450家族基因的表達預防DILI的發(fā)生。藥物通過轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞，通過第一階段代謝酶進行氧化反應，再通過第二階段代謝酶進行結(jié)合反應。藥物經(jīng)過每一個階段的代謝酶作用所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物都具有肝毒性，主要表現(xiàn)為激活活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、免疫反應、炎癥反應、線粒體和細胞核損傷，進而導致細胞凋亡。在第一階段，CYP450是最主要的代謝酶。所以，降低CYP450酶的表達是減輕藥物損傷的一個重要方式(見圖1)。為此，本研究在7702細胞中觀察肝爽顆粒的主要成分柚皮苷是否對已知的公認的具有肝毒性的藥物曲格列酮[9]和雙氯芬酸鈉[10]具有對抗作用，如果有，機制是否為降低CYP450系列酶的活性，期待為預防DILI提供新的思路。

圖1 DILI的機制 Fig 1 The mechanism of DILI

1 材料與方法

1.1 實驗細胞來源正常人肝細胞株HL-7702細胞保存于北京市肝衰竭與人工肝治療研究重點實驗室。

1.2 藥品制備將曲格列酮溶解于0.1%的二甲亞礬(DMSO)中配置成100 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中；將雙氯芬酸鈉溶解于0.1%的DMSO中配置成400 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中；將柚皮苷配置成20 mmol/L濃度原液，保存于-4 ℃中。

1.3 主要試劑和儀器Cell Counting Kit-8(CCK8)購自DojinDo東仁化學科技(上海)有限公司；SYBRTMPremix Ex TaqTM、SuperScript Ⅲ Platinum Twostep 實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒和總RNA提取試劑Trizol均購自美國Invitrogen公司；曲格列酮、雙氯芬酸鈉均購自美國MCE公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、雙抗(含青霉素、鏈霉素)購自美國Gibco公司。主要儀器：酶標儀購自美國Sigma公司；96孔板、24孔板購自德國Corning公司；Applied BiosystemsTMPCR熱循環(huán)儀購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 細胞培養(yǎng)HL-7702細胞于質(zhì)量濃度為100 g/L FBS、10 g/L雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細胞生長至80%融合時，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L EDTA-胰蛋白酶消化傳代。(1)取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中進行細胞毒性實驗。細胞分組：正常對照組、不同濃度曲格列酮組、1 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組、10 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組、100 μmol/L柚皮苷+不同濃度曲格列酮組；正常對照組、不同濃度雙氯芬酸鈉組、1 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組、10 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組、100 μmol/L柚皮苷+不同濃度雙氯芬酸鈉組。(2)接種于24孔板進行qRT-PCR檢測。細胞分組：正常對照組、1 μmol/L柚皮苷組、10 μmol/L柚皮苷組、100 μmol/L柚皮苷組。(3)接種于24孔板進行qRT-PCR檢測。細胞分組a：正常對照組、100 μmol/L曲格列酮組、1 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組、10 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組、100 μmol/L柚皮苷+100 μmol/L曲格列酮組；細胞分組b：正常對照組、500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、1 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、10 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組、100 μmol/L柚皮苷+500 μmol/L雙氯芬酸鈉組。

1.5 標本收集及檢測收集96孔板上清用于乳酸脫氫酶(LDH)水平檢測。分別用Trizol刮取培養(yǎng)板底部細胞放入1.5 ml EP管中，-80 ℃凍存，以備之后的qRT-PCR檢測。將上清培養(yǎng)基放入1.5 ml EP管中，-20 ℃儲存，以備血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)送檢。

1.6 CCK8檢測棄各個分組的96孔板的上清，加入質(zhì)量濃度為100 g/L CCK8的培養(yǎng)基100 μl，孵育30 min后，酶標儀中檢測吸光度值，波長為450 nm。

1.7 qRT-PCR檢測Trizol試劑提取HL-7702細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補cDNA，以此為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增片段，按SYBR Premis EX Taq Ⅱ試劑盒說明書加樣，用iQ5多重實時熒光定量PCR儀檢測。所檢測引物見表1，反應條件: 50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 0.15 s，60 ℃ 0.3 s， 44個循環(huán)；55 ℃ 4 s，41個循環(huán)(見表1)。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷減輕藥物肝細胞毒性的作用加入柚皮苷后，藥物所致細胞毒性得到明顯改善，100 μmol/L柚皮苷+曲格列酮組的IC50較曲格列酮組明顯升高(351 μmol/Lvs126 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=197 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=164 μmol/L)對曲格列酮所致DILI改善不明顯。同樣，100 μmol/L柚皮苷+雙氯芬酸鈉組的IC50較雙氯芬酸鈉組明顯升高(39 883 μmol/Lvs724 μmol/L)，而1 μmol/L柚皮苷(IC50=1 563 μmol/L)和10 μmol/L柚皮苷(IC50=719 μmol/L)對雙氯芬酸鈉所致DILI改變不明顯。LDH方面，100 μmol/L柚皮苷對曲格列酮所致DILI明顯降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改變不明顯。同樣，100 μmol/L柚皮苷對雙氯芬酸鈉所致DILI明顯降低，但1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷改變不明顯(見圖2)。

表1 qRT-PCR所檢測引物Tab 1 Primers detected by qRT-PCR

2.2 柚皮苷降低轉(zhuǎn)氨酶的作用根據(jù)上一步結(jié)果，分別選取曲格列酮100 μmol/L和雙氯芬酸鈉500 μmol/L制造DILI模型，在加入柚皮苷后，DILI HL-7702細胞的AST、ALT明顯降低(見圖3)。其中1 μmol/L柚皮苷的保護作用不明顯(P>0.05)，而10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷的保護作用明顯(P<0.05)(見表2～3)。

2.3 柚皮苷減輕凋亡的作用加入柚皮苷后，曲格列酮、雙氯芬酸鈉所致肝毒性HL-7702細胞的Caspase3基因表達明顯降低(見圖4)。1 μmol/L柚皮苷組、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

表2 不同濃度柚皮苷在降低曲格列酮所致HL-7702細胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用Tab 2 The effect of naringin on the transaminase induced by Tragllitazone

注：*:與曲格列酮組比較。

圖2 柚皮苷減輕藥物肝毒性的作用A：不同濃度柚皮苷在減輕不同濃度曲格列酮所致HL-7702細胞的肝毒性中的作用；B：不同濃度柚皮苷在減輕不同濃度雙氯芬酸鈉所致HL-7702細胞的肝毒性中的作用；C：不同濃度柚皮苷在降低不同濃度曲格列酮所致HL-7702細胞的LDH的作用；D：不同濃度柚皮苷在降低不同濃度雙氯芬酸鈉所致HL-7702細胞的LDH的作用

Fig 2 The role of naringin in reducing DILIA： the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; B: the role of different concentrations of naringin in reducing the hepatotoxicity of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium; C: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Tragllitazone; D: the effect of different concentrations of naringin on the LDH of HL-7702 cells induced by different concentrations of Diclofenac sodium

表3 不同濃度柚皮苷在降低雙氯芬酸鈉所致HL-7702細胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用Tab 3 The effect of naringin on the transaminase induced by Diclofenac sodium

注：*:與雙氯芬酸鈉組比較。

2.4 柚皮苷對于代謝酶基因表達的改變選取與曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關的CYP代謝酶基因表達，分別檢測1 μmol/L柚皮苷、10 μmol/L柚皮苷、100 μmol/L柚皮苷對CYP基因表達的改變。通過檢測發(fā)現(xiàn)，柚皮苷濃度越高，CYP基因改變越明顯(見圖5、表5)。1 μmol/L柚皮苷對CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP2B6等基因改變差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，10 μmol/L柚皮苷對CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7等基因表達的改變差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但100 μmol/L柚皮苷對所有CYP基因表達的改變差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

肝臟是人體最大的解毒器官，絕大多數(shù)藥物都具有肝臟毒性，目前根據(jù)DILI發(fā)病機制的概括總結(jié)，藥物經(jīng)磷脂雙分子層進入細胞，在CYP450系酶的消化代謝后，所產(chǎn)生的反應性代謝產(chǎn)物(reactive metabolite)會激活ROS、異常自身免疫調(diào)節(jié)以及炎癥反應，導致線粒體、細胞核損傷，繼而導致細胞死亡。因此，降低CYP酶功能，可作為預防DILI發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)[6,11-12]。

圖3 不同濃度柚皮苷在降低不同藥物所致HL-7702細胞肝毒性的轉(zhuǎn)氨酶的作用 A、B:曲格列酮;C、D:雙氯芬酸鈉 Fig 3 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugs A-B: Tragllitazone; C-D: Diclofenac sodium

圖4 不同濃度柚皮苷在降低曲格列酮所致肝毒性HL-7702細胞的Caspace 3的作用A:曲格列酮;B:雙氯芬酸鈉；

Fig 4 The effect of naringin on the transaminase induced by different drugsA: Tragllitazone; B: Diclofenac sodium；

圖5 不同濃度柚皮苷對曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關CYP基因表達的改變的檢測

Fig 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

表4 不同濃度柚皮苷對降低藥物所致肝毒性HL-7702細胞Caspase3基因表達改變的檢測Tab 4 The effect of naringin on the Caspase3 gene expression induced by drugs

注：*:與曲格列酮組比較；△ ：與雙氯芬酸鈉組比較。

對乙酰氨基酚是引起DILI最主要的藥物，對于對乙酰氨基酚所引起DILI的機制與防治已有相對全面的研究[13-14]。但除去對乙酰氨基酚，還有很多具有肝毒性的藥物，如曲格列酮、雙氯芬酸鈉等[15-16]，期待更多的機制研究與預防措施的出現(xiàn)。

近年，中醫(yī)藥在預防以及治療慢性疾病方面逐漸在國內(nèi)和國際獲得認可[17]，在肝病領域，中成藥，如肝爽顆粒，已被證實在治療慢乙肝、肝硬化以及延緩肝病進程方面均可發(fā)揮重要的作用[5,18-19]。而有研究發(fā)現(xiàn)，作為肝爽顆粒主要成分的柚皮苷，在抑制CYP450家族基因表達方面可發(fā)揮重要作用[7-8]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能夠通過抑制ROS系統(tǒng)，減輕氧化應激反應而抑制對乙酰氨基酚所致肝損傷[20]。但是對于更多的導致DILI的藥物，柚皮苷是否同樣能夠發(fā)揮保護作用？這種保護作用是否與其抑制CYP450家族基因表達有關？

本研究結(jié)果顯示，柚皮苷能夠減輕曲格列酮和雙氯芬酸鈉所致DILI的損傷，具有降低轉(zhuǎn)氨酶、減少細胞凋亡的作用。但這種改善具有劑量依賴性，其中100 μmol/L柚皮苷的保護作用最明顯，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的保護作用不明顯。比較CYP代謝酶基因改變情況發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L柚皮苷能夠明顯抑制其表達，1 μmol/L柚皮苷和10 μmol/L柚皮苷的抑制作用不明顯。

綜上，肝爽顆粒主要成分柚皮苷能夠通過抑制CYP酶的功能，從而起到預防DILI的作用，本次研究期待為臨床用藥提供依據(jù)，也為中藥復方制劑和單體的開發(fā)和改進提供線索。

表5 不同濃度柚皮苷對曲格列酮、雙氯芬酸鈉代謝相關CYP基因表達的改變的檢測Tab 5 CYP gene expression related to drug metabolism in different concentrations of naringin

注：*:與正常對照組比較。