林莉莉，郭麗倩，陳瀟瀟，游章湉，游水生，曹世江

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310027；3.中國科學(xué)院華南植物園退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院華南植物園廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650)

米櫧(Castanopsiscarlesii(Hemsl.)Hay.)為殼斗科栲屬喬木，是東亞地區(qū)具有代表性的建群種，是亞熱帶地區(qū)的常綠闊葉林組成樹種之一。它不僅適應(yīng)溫暖濕潤多雨的氣候，同時也能耐蔭，耐瘠薄干旱，適應(yīng)性強(qiáng)，在福建、湖北、四川、貴州、臺灣、日本等地區(qū)廣泛分布[1-3]。米櫧生長迅速，抗風(fēng)力強(qiáng)，又耐煙塵、抗污染并能殺菌，在營造防火林帶中有著廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿4-5]。由于現(xiàn)階段我國亞熱帶地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，人口密度增加，人類對米櫧群落的干擾影響比較嚴(yán)重，加之采伐強(qiáng)度大，導(dǎo)致米櫧群落退化嚴(yán)重[6]。因此開展米櫧DNA提取研究對其分子生物學(xué)以及遺傳多樣性等方面具有重要意義。

高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行基因檢測的重要基礎(chǔ)，PCR為基礎(chǔ)的基因檢測技術(shù)在遺傳多樣性、遺傳分析、親緣關(guān)系等各個方面都有廣泛的應(yīng)用[7]，所以得到高質(zhì)量的DNA是有效用于PCR擴(kuò)增、基因克隆、基因圖譜、進(jìn)化進(jìn)程分析的重要基礎(chǔ)，是成為植物分子技術(shù)分析的首要前提[8-10]。因此出現(xiàn)了針對各種栲屬植物，如赤枝栲(Castanopsiskawakamii)[11]、格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)[12]、絲栗栲(CastanopsisfargesiiFranch)[13]、紅錐(CastcmopsishystrixA.DC)[14]等植物基因組DNA提取方法的研究，采用了檸檬酸鈉法、尿素法、高鹽低pH法、SDS法、傳統(tǒng)CTAB法和試劑盒提取這6種方法，但至今尚未見有關(guān)米櫧基因組DNA提取方法的研究報道，參考現(xiàn)有的栲屬植物基因組DNA提取方法。本研究采用改良的CTAB法來提取米櫧基因組DNA，以期找到高效提取米櫧基因組DNA的方法，為其后續(xù)PCR、遺傳分析等方面的研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)所用的米櫧葉片采自福州鼓山風(fēng)景區(qū)，根據(jù)人類干擾程度的大小選擇6個不同的米櫧群落(表1)，于2016年6月采集新鮮葉片，凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

表1 6個米櫧群落的概況

1.2 試劑與儀器

主要試劑為DNA提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，1.0 mol·L-1NaCl，2%(w/v)CTAB，0.5%β-巰基乙醇(使用時現(xiàn)加入))，氯仿，異丙醇，75%乙醇，ddH2O等，所用試劑均為分析純。主要儀器有：低溫離心機(jī)，干式恒溫器，PCR儀，電泳儀，超微量分光光度計(jì)DeNovix，電泳凝膠成像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 秤取米櫧葉片0.05 g于干燥的研缽內(nèi)，加入適量液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中并加入預(yù)處理的DNA緩沖液500 μL，65 ℃水浴30 min，期間每隔10 min混勻1次；4 ℃，13000 r·min-1離心2 min，取上層水相并加入氯仿500 μL，混勻后靜置2 min；4 ℃，13000 r·min-1離心15 min，取上層水相，加入等體積已加入10%NaAC的異丙醇，上下顛倒混勻，在-20 ℃下醇沉30 min。4 ℃，13000 r·min-1離心15 min，收集沉淀，加入75%乙醇溶解、洗滌；4 ℃，13000 r·min-1離心3 min，重復(fù)2次；置于通風(fēng)櫥數(shù)分鐘，待管內(nèi)乙醇揮發(fā)殆盡，加入ddH2O 100 μL，震蕩混勻即為所提取的基因組DNA。

1.3.2 DNA檢測 取1 μL DNA樣品于超微量分光光度計(jì)DeNovix上測定DNA濃度、A260/230、A260/280。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并拍照記錄。

1.3.3 PCR檢測 以米櫧葉片提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測。用trnL為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)，反應(yīng)體系為模板500ng、引物10 pM、ddH2O 8 μL、Master Mix10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行40個循環(huán)；再于72 ℃延伸10 min[15]。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過電泳凝膠成像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)觀察并采集圖像。

表2分子標(biāo)記引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 米櫧葉片DNA的質(zhì)量濃度和純度

表3是經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測所得的每個米櫧群落內(nèi)5個米櫧葉片樣品DNA濃度和純度的平均值。結(jié)果表明，試驗(yàn)中所提取的DNA，A260/230值均在2.0左右，說明純度較高，多糖等雜質(zhì)較少；A260/280的值均在2.0左右，說明DNA中還有少量的RNA，但不影響后續(xù)試驗(yàn)操作。試驗(yàn)提取的米櫧DNA質(zhì)量濃度均在400～750 ng·μL-1之間，DNA得率在80～120 mg·g-1之間，在微量試驗(yàn)中產(chǎn)率較高，說明本方法能夠有效的提取到米櫧分子生物實(shí)驗(yàn)的DNA質(zhì)量。

表3 6個米櫧群落內(nèi)葉片DNA質(zhì)量濃度和純度的平均值

圖1 米櫧基因組DNA的紫外吸收曲線

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 以trnL為引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 米櫧PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

圖5 米櫧基因測序部分波峰圖

2.2 米櫧葉片基因組DNA的質(zhì)量

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用該方法所獲得的沉淀物能夠較好地溶解于乙醇中，在提取過程中多酚類物質(zhì)影響較小。由圖1、圖2可知，采用該方法提取的米櫧葉片基因組DNA質(zhì)量好，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，條帶明顯，且只有1條清晰的主帶，“拖尾”現(xiàn)象較小，DNA降解和RNA污染的現(xiàn)象也輕，DNA質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3是以采用trnL為引物的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。由圖3可得，采用本文改良的CTAB法所獲得的DNA結(jié)果，在trnL引物和反應(yīng)體系中能夠得到穩(wěn)定的擴(kuò)增片段，長度約為800 bp，主帶清晰、明顯，無雜帶，重復(fù)性好。由此可見，采用該方法所提取的米櫧DNA質(zhì)量高，可以應(yīng)用于以PCR為基礎(chǔ)的分子生物研究。

2.4 米櫧葉片基因組DNA測序結(jié)果

將PCR擴(kuò)增結(jié)果送到鉑尚生物技術(shù)有限公司測序得到結(jié)果。結(jié)果表明本次測定的序列長度均在800 bp左右，圖4為第5號米櫧群落樣品的測序結(jié)果之一，序列長度為788 bp，與YU-PIN CHENG利用該引物測序所得結(jié)果801 bp相似度高達(dá)97.3%[15]，在該基因中A占35.2%，G占15.6%，T占33.2%，C占16.0%，且基因測序結(jié)果有效區(qū)間的波峰圖中主峰明顯，沒有特異性條帶干擾(圖5)。因此利用該方法提取的DNA可用于米櫧遺傳多樣性的分析。

3 討論與結(jié)論

米櫧屬于頑拗植物，細(xì)胞中多糖、酚類、單寧等物質(zhì)含量較多[16]，在提取過程易褐化形成粘稠的物質(zhì)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)操作。通過前期的試驗(yàn)摸索，從中找到適合米櫧基因組DNA提取的方法。本次試驗(yàn)提取液中NaCl的含量為1.0 mol·L-1，用量減少，加入0.5%的β-巰基乙醇相較于常見植物DNA提取方法中的0.1%[17]用量有所增加，能夠有效地減少提取過程的褐變，與現(xiàn)有格氏栲的方法中3%[12]相比，本方法的用量降低了操作過程的毒性。實(shí)驗(yàn)省略了酚氯仿的使用，且氯仿在該過程中只使用1次，又進(jìn)一步減少了實(shí)驗(yàn)操作中的毒性。本方法使用10%的醋酸鈉去除基因組DNA中糖類的干擾，在-20 ℃下用異丙醇代替75%乙醇能使DNA更易醇沉。該方法使用的試劑均為實(shí)驗(yàn)室常見試劑，操作簡單，提取過程相對于試劑盒提取基因組DNA消耗時間少，整個操作時間在2 h左右，且在操作過程中有效調(diào)整了β-巰基乙醇的用量，減少氯仿的使用次數(shù)，省略了酚氯仿這些有毒物質(zhì)的使用，相較于傳統(tǒng)的CTAB法，本方法毒性較小，操作簡單，用時少；相對于試劑盒提取，本方法更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

葉綠體是植物細(xì)胞質(zhì)遺傳的重要單位，具有相對獨(dú)立的遺傳物質(zhì)(cpDNA)[18]。葉綠體基因組在植物分子標(biāo)記[19]、系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)[20]等方面有廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)使用的材料為福州鼓山米櫧的葉片，采用幼葉和成熟葉片均能達(dá)到良好的效果。利用紫外分光光度計(jì)檢測，在6個米櫧群落樣品中均提取到了較好的基因組DNA，提取過程中有效降低了DNA的降解，同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠用于PCR擴(kuò)增DNA模板?；蚪MDNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中均能夠得到穩(wěn)定的條帶，PCR產(chǎn)物條帶清晰，“拖尾”現(xiàn)象較少，且擴(kuò)增結(jié)果能夠得到穩(wěn)定序列結(jié)果，為今后對米櫧不同種群間的遺傳序列分析、基因定位等研究提供了較好的DNA提取方法。且利用本方法提取格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)的基因組DNA也取得了比較好的結(jié)果，因此本方法能夠?yàn)槊讬胶透袷翔嗟绕渌鄬僦参锏腄NA提取以及其它分子研究提供參考。