王正榮 ，張艷艷 ，徐雪萍 ，楊華 ，薄新文 *

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；

2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

胰闊盤吸蟲是一種常寄生于水牛、駱駝、綿羊和山羊胰管，偶爾也寄生于膽管的一種吸蟲，該蟲種是寄生于反芻動物的優(yōu)勢闊盤屬吸蟲。胰闊盤吸蟲的長期寄生會導(dǎo)致宿主胰管肥大，上皮增生，以及胰管周圍組織的纖維化，進(jìn)而引起胰闊盤吸蟲病[1]。該病在世界上很多國家均有報道，雖然已經(jīng)過多年的防控，但該病在一些地區(qū)的感染率依然較高，可達(dá)到47%-55%[2]。研究報道稱胰闊盤吸蟲的致病性相對較弱，但胰闊盤吸蟲可能引起被感染動物生產(chǎn)性能的下降，包括體重減輕，產(chǎn)肉性能下降，以及最終導(dǎo)致死亡[3]。也有一些研究報道顯示，由于某些特定群體的飲食習(xí)慣，胰闊盤吸蟲偶爾也會感染人[4-5]。目前還沒有商品化的用于預(yù)防胰闊盤吸蟲病的疫苗，對該病主要采取藥物防治方法，常用藥物有吡喹酮或三氯苯咪唑等[6]。

新疆是畜牧業(yè)大省，牛羊養(yǎng)殖數(shù)量較大，且養(yǎng)殖方式呈現(xiàn)多樣化，包括放牧、半舍飼和全舍飼等。在這種多種養(yǎng)殖模式并存的現(xiàn)狀下，其寄生蟲感染，尤其是胰闊盤吸蟲感染情況如何，相關(guān)文獻(xiàn)較少。因此，為了解筆者所在石河子地區(qū)綿羊胰闊盤吸蟲的感染現(xiàn)狀，我們采用常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定以及PCR聚合酶鏈反應(yīng)分子鑒定方法，于2014年2月-2015年1月在石河子開展羊胰闊盤吸蟲流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗羊47只，其中42只來自石河子143團(tuán)某個體羊場，3只來自石河子活畜市場，2只來自石河子141團(tuán)。試驗羊中有35只母羊，均為新疆軍墾細(xì)毛羊雜交羊，12只公羊，2只為本地大尾羊，其余為本地土種羊與新疆軍墾細(xì)毛羊雜交羊，2～5歲不等，冬季圈養(yǎng)，夏季在天山深處夏牧場放牧，春、秋兩季在本地山間牧場放牧，于2014年3月25日前后，例行春季驅(qū)蟲，所用藥物為阿維菌素注射液，0.2 mg/kg體重。

1.2 試驗方法

連續(xù)12個月，每月剖檢綿羊3～4只。胰臟用剪刀沿胰管剪開，放水中漂洗，檢查并挑出蟲體，鑒定蟲種。

1.3 胰闊盤吸蟲的PCR鑒定

用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)公司）提取蟲體DNA，然后用于擴(kuò)增闊盤屬吸蟲18S rRNA部分基因的PCR分析[7]；所有的PCR分析均包括陽性對照，同時采用高壓滅菌去離子水為模板作為陰性對照。PCR 擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性5 min，94°C變性35 s，55°C復(fù)性45 S，72°C延伸2 min，35個循環(huán)，72°C延伸10 min，所有PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下檢測。擴(kuò)增引物如下，上游引物：5'-GGCTCATTAAATCAGCTATGGTT-3'，下游引物：5'-ACGACTTTTACTTCCTCTAAAT-3'。

1.4 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用康為世紀(jì)公司快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）軟件將測序獲得基因序列與genbank中的類似序列進(jìn)行比較。然后，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建以18S rRNA基因為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建采用 neighbor-joining法，bootstrapped的值為1000，同時以大片吸蟲18S rRNA基因作為進(jìn)化樹的外組。

2 結(jié) 果

2.1 胰闊盤吸蟲的感染情況

被檢的47只羊中有6只檢出胰闊盤吸蟲，感染率為12.77%，感染羊中僅一只羊感染強(qiáng)度較高，達(dá)300條，另外幾只羊感染強(qiáng)度不高，分別感染1～25條不等。少量感染時胰臟未見明顯病變。大量感染時，胰臟腫大，外觀呈黑色條索狀扭曲，質(zhì)地變硬，胰管內(nèi)壁充血、出血、增厚，周圍腸系膜淋巴結(jié)腫脹，呈黑豆?fàn)?，感染羊極度虛弱消瘦。

2.2 胰闊盤吸蟲成蟲形態(tài)學(xué)鑒定

活的胰闊盤吸蟲為棕紅色，固定后為灰白色。蟲體扁平，較厚，呈長卵圓形，吸盤發(fā)達(dá)，口吸盤較腹吸盤大。咽小，食道短，腸支簡單。睪丸2個，圓形或略分葉，左右排列在腹吸盤后。雄精囊呈長管狀，位于腹吸盤前方與腸支之間。生殖孔開口于腸叉的后方。卵巢分葉3～6瓣，位于睪丸之后，體中線附近，受精囊成圓形，在卵巢附近。子宮彎曲，內(nèi)充滿棕色蟲卵，位于蟲體的后半部。卵黃腺呈顆粒狀，位于蟲體中部兩側(cè)，見圖1。我們選取每只羊來源的蟲體各一個，共計6個蟲體，對其大小進(jìn)行了測量，結(jié)果顯示其大小為8.0～16 mm×5.0～5.8 mm。

圖1 胰闊盤吸蟲的蟲體壓片以及伊紅染色圖片

2.3 胰闊盤吸蟲的PCR鑒定

本試驗對采集的18個蟲體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段的大小為528 bp左右，與預(yù)期大小一致，見圖2。

圖2 18個胰闊盤吸蟲的PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.3 基于18S RNA部分序列的遺傳進(jìn)化分析（圖3）

圖3 石河子胰闊盤吸蟲分離株遺傳進(jìn)化分析

本研究采用PCR方法擴(kuò)增了18個吸蟲的18S RNA基因的部分序列，最終選取其中6個蟲體的18S RNA基因擴(kuò)增序列進(jìn)行測序及遺傳進(jìn)化分析，石河子分離蟲株依次命名為SHZ-1，SHZ-2，SHZ-3，SHZ-4，SHZ-5以及 SHZ-6。同時我們以 Genbank數(shù)據(jù)庫中的胰闊盤吸蟲 （Eurytrema pancreaticum，NO.DQ401034.1）、 腔闊盤吸蟲 （Eurytrema coelmaticum，NO.DQ401035.1）、 枝岐腔吸蟲（Dicrocoelium dendriticum,NO.Y11236.1）、 東 方 岐 腔 吸 蟲 （Dicrocoelium orientalis，NO.EF547131.1）、 窄 體 吸 蟲（Lyperosomum collurionis，NO.AY222143.1）、雙腔吸蟲（Paraconcinnum leirsi，NO.JN831598.1）以及大片吸蟲（Fasciola gigantica，NO.AJ004804.1）18S RNA基因為參照序列進(jìn)行序列比對及進(jìn)化分析。結(jié)果表明，石河子分離蟲株與胰闊盤吸蟲聚為一支，親緣關(guān)系最近，與腔闊盤吸蟲的親緣關(guān)系次之。

3 討 論

寄生性吸蟲對全球人類以及動物的健康具有不可忽視的危害性，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球有超過4 000萬人感染食源性吸蟲病，同時有超過10%的人群存在感染的風(fēng)險。大多數(shù)吸蟲病都流行于中低收入國家和地區(qū)[8]，其中闊盤屬吸蟲主要寄生于反芻動物的胰腺和膽管，該寄生蟲病廣泛流行于全球多個國家。盡管闊盤屬吸蟲病對人類和動物健康造成威脅，但該病仍然是被低估/忽視的吸蟲病之一。檢索CNKI數(shù)據(jù)庫顯示，胰闊盤吸蟲病在我國大多數(shù)地區(qū)均有發(fā)生，寄生宿主涉及牛、綿羊、山羊、以及野生的山麂等，同時有兩例胰闊盤吸蟲感染人的研究報道[4-5]，說明該病在我國普遍存在，且已有感染人的報道，應(yīng)給予足夠重視。

本研究采用常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)方法對石河子地區(qū)綿羊胰闊盤吸蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究。試驗結(jié)果表明，在檢測的47只綿羊中，有6只綿羊存在胰闊盤吸蟲感染，感染率為12.77%。同時我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)，除胰闊盤吸蟲外，在被檢的47只綿羊中，還存在其它5種吸蟲的感染，分別是寄生于肝臟的肝片吸蟲、矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲以及寄生在小腸的斯氏吸蟲等，總的吸蟲感染率為100%[9]。究其原因，筆者認(rèn)為有以下兩方面因素：一是此次調(diào)查的綿羊群所處的環(huán)境能夠滿足吸蟲整個生活史所需條件。本次調(diào)查的羊群屬于天然放牧飼養(yǎng)模式，該牧區(qū)水草豐茂，且吸蟲的中間宿主蝸牛、陸地螺、螞蟻等隨處可見，這為吸蟲生長發(fā)育提供了有利環(huán)境條件；二是目前大多數(shù)地區(qū)依然以阿維菌素為主要驅(qū)蟲藥物進(jìn)行春秋兩季常規(guī)驅(qū)蟲，該藥物對體表寄生蟲以及胃腸道線蟲有較好的驅(qū)除作用，但對吸蟲幾乎無效。因此建議在牧區(qū)選用阿維菌素類藥物常規(guī)驅(qū)蟲的同時，還應(yīng)考慮選用丙硫咪唑、三氯苯咪唑或吡喹酮等藥物加強(qiáng)對吸蟲病的防治。