趙 雄，黃李勇，李 彬，李志強(qiáng)，依明·蘇來曼

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

角蛋白家族是與羊毛纖維相關(guān)的主要基因，其中角蛋白的表達(dá)最為豐富，動物表皮中的蛋白質(zhì)大多數(shù)為角蛋白，且它是構(gòu)成羊毛纖維的主要蛋白[1]。角蛋白家族包括由多基因家族編碼的最少有30種蛋白質(zhì)分子[2]。

羊毛具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，羊毛纖維組成有角蛋白中間絲和角蛋白輔助蛋白，其中KRT31和KRT85基因?qū)儆诮堑鞍字虚g絲。羊毛質(zhì)量會受到編碼這些蛋白質(zhì)的基因影響，所以可作為育種的候選基因[3]。

應(yīng)詩家等[4]采用PCR技術(shù)，檢測了5個群體，角蛋白中間絲I型基因第1外顯子的遺傳多態(tài)性，并與綿羊羊毛性狀相關(guān)性分析。得出在480bp處5個綿羊群體中均有2個等位基因突變，但是位點(diǎn)與羊毛纖維直徑不相關(guān)。杜文敬等[5]以綿羊基因組DNA為模板克隆獲得了綿羊中間絲蛋白基因，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，在綿羊成纖維細(xì)胞中K2.10啟動子具有表達(dá)活性。晏華春[6]對和田羊角蛋白家族5個候選基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，得出KRT31基因EE基因型和EF、FF基因型差異顯著，F(xiàn)F、EF基因型差異極顯著；與羊毛細(xì)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，得出三個基因型差異均不顯著。張敏[7]對512只阿勒泰羊個體毛絨樣品進(jìn)行品質(zhì)性狀測定，并采PCR-SSC和DNA直接測序技術(shù)，研究了在阿勒泰羊中的KRT36基因的遺傳多態(tài)性，得出KRT36-2中三種基因型均對阿勒泰羊絨毛纖維直徑等九個性狀有極顯著影響(P＜0.01)，所以可以作為以上品質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇的有效 DNA標(biāo)記。狄江[8]研究發(fā)現(xiàn)KRT38是羊毛、羊絨的主要結(jié)構(gòu)成分，該基因可作為候選基因進(jìn)行下一步研究。

本試驗(yàn)選擇和田羊作為試驗(yàn)材料，采用PCR-SSCP和DNA測序等技術(shù)對和田羊KRT31和KRT85基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，并和其對應(yīng)的羊毛性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，為了尋找出和羊毛性狀有關(guān)的基因，從而為今后和田羊的育種工作和改善羊毛性狀提供科學(xué)依據(jù)，以及增加農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)收入，改善生活。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本

本試驗(yàn)材料是和田羊400只，其年齡1～1.5周歲，個體無明顯差異，健康無病。樣品為血樣5 mL。

1.1.2試驗(yàn)藥品

30%非變性聚丙烯酰胺，C2H6O，70%C2H6O，Tris平衡酚， 核酸提取液，Taq PCR MasterMix，Loading Buffer，DL2000，雙蒸水，CH2O，T10E10，T10E1，瓊脂糖粉，AgNO3，NaOH 等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取

方法為：酚-氯仿抽提法。將血液中和田羊基因組DNA，溶于T10E1溶液中，放置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

參考綿羊KRT31和KRT85基因序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。在生物公司進(jìn)行引物合成。

表1 引物信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件（見表2）

表2 PCR 20 μL反應(yīng)體系

1.2.4 PCR-SSCP檢測

吸取10 μL PCR產(chǎn)物加入7μL變性劑98℃變性10 min，然后冰浴30 min，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳300 V，50 mA空跑30 min，預(yù)跑10 min，180 V電泳15 h后用硝酸銀溶液染色30 min，氫氧化鈉和甲醛溶液顯色，顯色后置于凝膠成像儀中成像、分析、判定各種基因型，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行保存。

1.2.5 羊毛伸直長度的測定

(1)將所抽取的毛樣整齊的排在黑絨板上，剝?nèi)ヅc此相連的其他毛樣。(2)用載玻片壓住毛樣的一側(cè)，然后用鑷子從另一側(cè)隨機(jī)抽取毛樣，直到彎曲度消失。(3)記錄測量毛樣的伸直長度，精確到1mm。（參考羊毛纖維長度試驗(yàn)方法GB/T 6501-1986國家標(biāo)準(zhǔn)）

1.2.6 顯微投影儀法測定羊毛細(xì)度

（1）隨機(jī)取出10根以上的毛樣，切成長度為0.4～0.7 mm碎片。（2）加入適量的甘油，然后將一些樣品放在載玻片上。（3）把物鏡測微尺輕放到顯微鏡載物臺上，使其投影能夠呈現(xiàn)在屏幕上來看物鏡測微尺每一小格的長度大小。把投影倍數(shù)調(diào)制放大到原來的500倍測量羊毛直徑。調(diào)節(jié)投影屏幕的距離，然后把物鏡測微尺取下，把帶有試樣的載玻片放在載物臺上，并用楔尺來測量樣品羊毛纖維的直徑。（4）用楔尺逐個測量每根纖維的直徑并按順序測量。相應(yīng)地記錄每個測量的纖維直徑。（5）重復(fù)制備三個羊毛樣品，并選擇其中兩個進(jìn)行測量。每個片子的測量條數(shù)不小于400，結(jié)果使用算術(shù)平均值。（參考羊毛纖維直徑試驗(yàn)方法-投影顯微鏡法GB/T 10685-1989國家標(biāo)準(zhǔn)）

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA結(jié)果檢測

圖1是在1%的瓊脂糖凝膠上將提取的DNA進(jìn)行點(diǎn)樣，得出的結(jié)果是基因組DNA各泳道條帶清晰且無拖尾現(xiàn)象，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 和田羊DNA檢測結(jié)果

2.2 KRT31基因

2.2.1 KRT31基因PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

用2%濃度的瓊脂糖凝膠對所得產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，所得目的片段清晰明亮，條帶單一且無雜帶，片段大小在162bp與預(yù)期想的擴(kuò)增的片段大小接近，所以PCR產(chǎn)物可用于后續(xù)的SSCP試驗(yàn)。

圖2 KRT31的PCR檢測結(jié)果

2.2.2 KRT31基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

KRT31基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳6 h，檢測結(jié)果如圖3所示，結(jié)果出現(xiàn)了兩種不同類型的條帶，分別定義為GG型和GA型。

圖3 KRT31基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

2.2.3 KRT31基因的測序結(jié)果

選擇KRT31基因擴(kuò)增的不同類型PCR產(chǎn)物各2個樣品送生物測序，測序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的綿羊KRT31基因序列進(jìn)行多序列比較，結(jié)果顯示KRT31基因在外顯子3的174 bp處存在A堿基的缺失，通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因A堿基的缺失，使色氨酸缺失，結(jié)果如圖4。

圖4 KRT31基因的測序結(jié)果

2.2.4 KRT31基因的基因頻率和基因型頻率

由表3可知，在檢測的和田羊群體中，KRT31基因存在2種基因型：GG和GA型，基因頻率分別為0.68和0.32。G等位基因頻率為0.84，A等位基因頻率為0.16。等位基因G為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，KRT31基因在和田羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

表3 KRT31基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.2.5 KRT31基因的遺傳參數(shù)值

從表4可以看出，和田羊KRT31基因純合度為0.7312，基因雜合度為0.2688，有效等位基因?yàn)?.368，多態(tài)信息含量為0.233。和田羊KRT31基因多態(tài)位點(diǎn)屬于低度多態(tài)（PIC<0.25）。

表4 KRT31基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量

2.2.6 KRT31基因多態(tài)性與羊毛性狀的關(guān)聯(lián)分析

KRT31基因的不同基因型與羊毛性狀關(guān)聯(lián)性分析：從表5看出，GG基因型和GA基因型的羊毛長度差異顯著（P<0.05），但是羊毛細(xì)度差異不顯著（P>0.05）。

表5 不同基因型與羊毛性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.3 KRT85基因

2.3.1 KRT85基因PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

用2%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示，所得目的片段清晰明亮，條帶單一且無雜帶，片段大小在427bp與預(yù)期想的擴(kuò)增的片段大小接近，所以PCR產(chǎn)物可用于后續(xù)的SSCP試驗(yàn)。

圖5 KRT85的PCR檢測結(jié)果

2.3.2 KRT85基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

KRT85基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳16 h，檢測結(jié)果如圖6所示，結(jié)果出現(xiàn)了兩種不同類型的條帶，分別定義為AA型和AB型。

圖6 KRT85基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

2.3.3 KRT85基因的測序結(jié)果

選擇KRT85基因擴(kuò)增的不同類型PCR產(chǎn)物各2個樣品送生物公司測序，測序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的綿羊KRT85基因序列進(jìn)行多序列比較，結(jié)果顯示KRT85基因在外顯子2的204 bp處存在A到G的突變，可以記作A204G。通過圖7和8運(yùn)用MEGA7軟件對氨基酸序列進(jìn)行比較分析，KRT85基因上A204G處的突變并未使氨基酸的編碼發(fā)生改變，此位點(diǎn)突變?yōu)橥x突變。

圖7 KRT85基因的測序結(jié)果

圖8 各基因型測序峰圖

2.3.4 KRT85基因的基因頻率和基因型頻率

由表6可知，在檢測的和田羊群體中，KRT85基因存在2種基因型：AA和AB型，基因頻率分別為0.33和0.67。A等位基因頻率為0.67，B等位基因頻率為0.33。等位基因A為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，KRT85基因在和田羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表6 KRT85基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.3.5 KRT85基因的遺傳參數(shù)值

從表7可以看出，和田羊KRT85基因純合度為0.556，基因雜合度為0.444，有效等位基因?yàn)?.8，多態(tài)信息含量為0.346。和田羊KRT85基因多態(tài)位點(diǎn)屬于中度多態(tài)（0.25

表7 KRT85基因的遺傳參數(shù)

2.3.6 和田羊KRT85基因多態(tài)性與羊毛長度的關(guān)聯(lián)分析

KRT85基因的不同基因型與羊毛性狀關(guān)聯(lián)性分析：分析表8得出，AA和AB 2種基因型的羊毛長度及細(xì)度差異均不顯著（P>0.05）。

表8 不同基因型與羊毛性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

3 討 論

本研究中，多態(tài)信息含量分別為0.233和0.346。和田羊KRT31基因多態(tài)位點(diǎn)屬于低度多態(tài) （PIC＜0.25），而KRT85基因多態(tài)位點(diǎn)屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明在這兩個位點(diǎn)和田羊群體遺傳變異水平低，變異程度差異不大。同時也表明在今后和田羊培育中可以加強(qiáng)人工選擇力度，為新疆和田羊分子育種工作打下理論基礎(chǔ)。

晏華春等[9]以400只和田羊血樣為材料，研究了和田羊KRT31基因的多態(tài)性，并與羊毛細(xì)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果是和田羊KRT31基因中存在3種基因型：EE、EF和FF，但三種基因型之間的羊毛細(xì)度差異均不顯著（P＞0.05）。張露[10]以600只沂蒙長毛兔育種群為試驗(yàn)材料，利用混池測序?qū)ζ溥M(jìn)行多態(tài)性檢測，得出KRT31基因的位點(diǎn)-524對粗毛纖維直徑有顯著影響（P＜0.05）。馬依拉·吐爾遜[11]以中國美利奴羊?yàn)樵囼?yàn)材料，研究了 KRT27、KRT31、KRT36、KRT38、KRT81和 KRT85基因，得出KRT31基因 Q1位點(diǎn)存在CC、CD基因型，該基因?yàn)橹卸榷鄳B(tài)，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與羊毛直徑差異顯著（P＜0.05）。

有關(guān)于KRT基因及其多態(tài)性的研究主要集中在人與家畜等領(lǐng)域。有人發(fā)現(xiàn)人、牛、綿羊KRT基因的系統(tǒng)發(fā)育具有高度的一致性，且序列保守性較強(qiáng)[12]。迪麗娜熱·阿布都熱合曼[13]以中國美利奴羊?yàn)樵囼?yàn)材料，運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)研究了KRT85基因，得出KRT85-1不同基因型對中國美利奴羊羊毛彎曲數(shù)有顯著影響（P＜0.05）。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用PCR-SSCP技術(shù)和DNA測序技術(shù)，對新疆和田羊KRT31和KRT85基因的遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，新疆和田羊在KRT31基因的第3外顯子174bp區(qū)域存在A堿基的缺失，共產(chǎn)生2種基因型：GG和GA型，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)GG基因型和GA基因型的羊毛長度顯著（P＜0.05）。在KRT85基因的第2外顯子204bp區(qū)域存在A到G的突變，共產(chǎn)生2種基因型：AA和AB型，關(guān)聯(lián)分析AA和AB 2種基因型的羊毛長度及細(xì)度差異均不顯著（P＞0.05）。則KRT31基因與羊毛長度性狀相關(guān)，為今后發(fā)展羊毛資源與改善羊毛品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)，而KRT85基因應(yīng)加大樣本含量或在其它外顯子區(qū)域進(jìn)行研究。