冒德壽 牛云蔚 姚征民 肖 晴 肖作兵* 馬 寧 朱建才

（1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 昆明650231 2 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 上海201418 3 上海海洋大學(xué) 上海201306）

中國白酒，也被稱為白酒或燒酒，是一種在全世界享有盛名的蒸餾酒，尤其是在中國。通常乙醇含量在40%～55%[1]。中國白酒按傳統(tǒng)的香型主要可分為：清香型、濃香型、醬香型、米香型和其它香型（如鳳香型、兼香型）。不同香型的白酒，具有不同的風(fēng)格特點(diǎn)[2]。其中，清香型白酒因其果香和花香宜人而深受廣大消費(fèi)者喜愛，尤其在中國北方地區(qū)人們更加偏愛清香型白酒。眾所周知，白酒的品質(zhì)取決于許多因素，如原料和發(fā)酵過程等。此外，清香型白酒的香氣也是產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要因素。對于研究人員來說，掌握清香型白酒中的重要香氣化合物對提升香氣品質(zhì)至關(guān)重要。

近年來，固相微萃取技術(shù)（SPME）和氣相色譜-嗅覺測量技術(shù)（GC-O）廣泛應(yīng)用于白酒中的香氣化合物的定性、定量，研究人員通過這些技術(shù)對清香型白酒中的關(guān)鍵香氣化合物進(jìn)行了初步探索。丁云連[3]通過浸入式固相微萃?。―I-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）鑒定出汾酒中的苯乙醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、β-苯乙醇、辛酸乙酯、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和1-辛醇這10 種香氣物質(zhì)，初步作為特征香氣物質(zhì)。杜艷紅等[4]采用DI-SPME 從紅星二鍋頭原酒中共鑒定出138 種風(fēng)味物質(zhì)。張恩[5]應(yīng)用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合AEDA（芳香化合物萃取稀釋法）發(fā)現(xiàn)洋河新酒與老酒中重要風(fēng)味化合物為己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯。高文俊等[6]應(yīng)用HS-SPME、液液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜及氣相色譜-氫火焰離子化檢測技術(shù)對清香型青稞酒進(jìn)行研究，共分析定量了69 種香氣成分，并結(jié)合香氣活力值（OAV）得到青稞酒中最重要的香氣成分為3-甲基丁醛。隨后，又對3種清香型白酒采用香氣重組和遺漏試驗(yàn)驗(yàn)證酒中酯類的重要性[7]。姜曉坤等[8]采用HS-SPME 萃取同山高粱酒中的香氣成分，從傳統(tǒng)同山高粱酒中檢測到35 種香氣成分，其中主要香氣成分為乙酸乙酯、3-甲基丁醇、丁酸乙酯、己酸乙酯。王志娟等[9]優(yōu)化HS-SPME 條件萃取竹葉青酒中的香氣物質(zhì)，分離得到65 種香氣化合物?？略穂10]通過HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對臺灣金門高粱酒鑒定出46 種成分，并得出酯類化合物對香氣有重要貢獻(xiàn)。大部分研究工作主要集中對單一品牌清香型白酒的香氣成分進(jìn)行分析，而對多種清香型白酒的特征香氣成分研究較少，并且對5 種典型清香型白酒的研究報道更是罕見。

數(shù)理統(tǒng)計分析探究白酒香氣物質(zhì)之間的作用規(guī)律是深入研究白酒特征香氣的重要拓展之一，多元統(tǒng)計分析是研究客觀事物中多個因素（或多個變量）之間相互關(guān)系的方法，如單因素方差分析[11]，主成分分析[12]，偏最小二乘回歸[13-14]。張莉等[15]利用系統(tǒng)聚類方法提出一種結(jié)合理化性質(zhì)來減少白酒品評中主觀因素的新方法。Camara 等[16]將葡萄酒的組分分類后進(jìn)行主成分分析，并逐步剔除掉干擾變量，將主成分得分與變量載荷對應(yīng)作圖，直觀展現(xiàn)葡萄酒種類與物質(zhì)之間的關(guān)系。馬燕紅等[17]運(yùn)用多元線性回歸和偏最小二乘法，建立一個白酒組成與其酒齡的相關(guān)模型，所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力，可實(shí)現(xiàn)清香型白酒酒齡的預(yù)測。邵燕等[18]通過建立多元回歸模型，分析基礎(chǔ)酒酒骨架成分與感官評分之間的相關(guān)性，為濃香型白酒的感官評價提供了較為科學(xué)的理論基礎(chǔ)。牛云蔚[19]用PLSR 方法研究了不同發(fā)酵工藝參數(shù)對特征香氣物質(zhì)和特征呈味物質(zhì)形成的貢獻(xiàn)，并找出各個發(fā)酵參數(shù)與某些特征香氣物質(zhì)和呈味物質(zhì)的相關(guān)性。然而，多元統(tǒng)計分析在清香型白酒中的運(yùn)用較少，利用偏最小二乘法研究清香型白酒中香氣物質(zhì)作用規(guī)律鮮見報道。

本文主要研究：1） 通過感官分析來描述不同產(chǎn)地清香型白酒的香韻特征；2）定性、定量分析重要香氣化合物；3）通過PLSR 探究白酒樣品，感官屬性以及重要香氣化合物之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 白酒 來自不同地區(qū)的5 種典型清香型白酒：國色清香（清香型，體積分?jǐn)?shù)53%，河南寶豐酒業(yè)有限公司）、紅星二鍋頭酒（清香型，體積分?jǐn)?shù)53%，北京紅星股份有限公司）、杏花村世家（清香型，體積分?jǐn)?shù)53%，山西杏花村汾酒集團(tuán)有限公司）、汾酒（清香型，體積分?jǐn)?shù)53%vol，山西杏花村汾酒集團(tuán)有限公司）、金門高粱酒（清香型，體積分?jǐn)?shù)58%，臺灣金門酒廠寶業(yè)股份有限公司）。所有酒樣（每瓶500 mL）均來自對應(yīng)的合作釀酒廠，并在4 ℃下貯藏。

1.1.2 試劑 氯化鈉、無水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，400 mg/L）、正構(gòu)烷烴C7～C30，美國Sigma 上海分公司。

1.1.3 儀器 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 （GC7890AMS5975C），美國Agilent 公司；碳分子篩-二乙烯基苯-聚二甲基硅氧烷（CAR/DVB/PDMS，50/30 μm）萃取頭，美國Supelco 公司；HH-2 型水浴鍋，國華電器有限公司；ODP2 嗅聞儀，德國Gerstel 公司。

1.2 測試方法

1.2.1 頂空固相微萃取 將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進(jìn)樣口經(jīng)250 ℃老化15 min 備用；準(zhǔn)確移取白酒樣品5 mL 于20 mL 螺口頂空瓶中，并加入1 g 氯化鈉和20 μL 內(nèi)標(biāo)2-辛醇。使用帶隔墊的鋁蓋密封，于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱平衡5 min。然后將固相微萃取裝置的針頭穿透隔墊插入頂空瓶內(nèi)上方，固定好固相微萃取的手柄，小心推出纖維頭并開始計時，吸附45 min 后取出，隨即插入GC-MS 儀器的進(jìn)樣口，在250 ℃溫度下解吸5 min。

1.2.2 GC-MS 分析條件 GC 條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP-INNOWAX （60 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm），起始柱溫為40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min 升到100 ℃，然后以5 ℃/min 升到230 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度230 ℃；載氣He，流速為1 mL/min，無分流進(jìn)樣。

MS 條件：電離方式為EV，電子能量70 eV，載氣為He，燈絲發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度為250 ℃，接口溫度為250 ℃，掃描質(zhì)量范圍為35～450 m/z。

1.2.3 GC-O 方法 嗅聞條件：ODP2 嗅聞儀的傳輸線溫度250 ℃，氣體為N2，接口溫度為180 ℃。

1.2.4 定性與定量分析

1.2.4.1 定性分析 采用MS、保留指數(shù)（Retention index，RI）和嗅聞3 種方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。MS 是通過人工解析并使用計算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫NIST05進(jìn)行對照確定。RI 定性是按1.2.2 節(jié)GC 色譜條件下，通過對C7～C30正構(gòu)烷烴的色譜掃描，計算得到各化合物的RI，并與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的RI 值進(jìn)行比對，即可對物質(zhì)進(jìn)行有效定性分析。嗅聞是將評價員描述的化合物香味特征與文獻(xiàn)報道對比。

1.2.4.2 定量分析 采用內(nèi)標(biāo)法對各化合物的濃度進(jìn)行定量分析，將Osme value≥2 的香氣物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品配成混合溶液，并用無水乙醇定容。稀釋7 個濃度梯度的混合溶液，在每個梯度中加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇和氯化鈉，用于定量分析。

1.2.5 感官評價 清香型白酒的香氣特征由訓(xùn)練有素的小組評估，包括10 個成員（22～40 歲），4 個女性和6 個男性，所有感官人員屬于實(shí)驗(yàn)室工作人員，并且在感官描述分析中具有長期經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)ISO 8589 標(biāo)準(zhǔn)感官分析方法[20-21]和GB/T 1010345-2007，5 次感官討論會議，每次1.5 h。在3 次初步討論會議中，小組成員徹底討論了清香型白酒的香氣特性和7 個屬性（糧香、清香、酸香、甜香、果香、窖香、花香），這7 種感官屬性所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)參照物分別是：糧香對應(yīng)糠醛，清香對應(yīng)庚醛，酸香對應(yīng)乙酸，甜香對應(yīng)2，3，5，6-四甲基吡嗪，果香對應(yīng)十二酸乙酯，窖香對應(yīng)己酸乙酯，花香對應(yīng)乙酸苯乙酯。

在第4 和第5 次會議中，要求小組成員在10點(diǎn)強(qiáng)度等級上以隨機(jī)順序?qū)悠返母泄賹傩赃M(jìn)行評級（0= 不存在，1= 非常低，并且9= 非常高）。在20 ℃下，在50 mL 樣品杯中評價恒定體積15 mL 的清香型白酒，樣品杯被隨機(jī)3 位數(shù)編碼。在潔凈的空氣條件下，每次嗅聞間隙為20 s。

它使我們不斷去消費(fèi)自我預(yù)期的那個形象?！翱雌饋砀灰稽c(diǎn)”。這不但賦予了他們社交的談資，城市生活的安全感，更證明了他們的選擇是有意義的，是正確的。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 方差分析：使用SPSSv13.0（SPSSInc.，Chicago，IL，USA）評價來自描述性分析的數(shù)據(jù)。進(jìn)行Duncan 多重比較檢驗(yàn)的方差分析以確定每個感覺屬性的個體樣品之間的差異。

偏最小二乘分析 （PLSR）：通過使用UNSCRAMBLERv9.8（CAMOASA，Oslo，Norway）探 討清香型白酒樣品，感官結(jié)果和香氣化合物之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種清香型白酒主要香氣成分分析

應(yīng)用頂空固相微萃取方法將清香型白酒中揮發(fā)性成分分離，并通過GC-MS 和GC-O 技術(shù)分析，在5 種清香型白酒中共鑒定出72 種香氣化合物，包括酯類29 種，醇類13 種，醛類8 種，酮類6種，酸類3 種，烯烴類5 種，酚類3 種，其它類5種。

由于清香型白酒的特征主要是清和甜，清香型白酒在陳化和老熟階段產(chǎn)生的香氣物質(zhì)大部分為酯類和醛類物質(zhì)，酯類物質(zhì)主要在發(fā)酵期間，是酵母或絲狀真菌的代謝產(chǎn)物，通過脂肪酸酯化得來[22]，使得清香型白酒的果香氣息透發(fā)。香氣強(qiáng)度值高的主要集中在乙酯類化合物，其中乙酸乙酯（香氣強(qiáng)度值≥3）、異戊酸乙酯（香氣強(qiáng)度值≥3.5）、己酸乙酯（香氣強(qiáng)度值≥3.83）、辛酸乙酯（香氣強(qiáng)度值≥4）等。己酸乙酯（菠蘿樣香氣）是果香香韻的典型代表，也是醬香型白酒和濃香型白酒中的重要酯類化合物[23]，因此在GC-O 嗅聞過程中容易嗅辨到。對于醛類物質(zhì)來說，糠醛（杏仁氣味和甜味）、壬醛、2-庚醛是在茅臺酒中存在，構(gòu)成香氣輪廓的重要醛類物質(zhì)[2]。

在醇類中，5 種清香型白酒中香氣強(qiáng)度值較高的有異戊醇和β-苯乙醇，一般情況下，用于清香型白酒生產(chǎn)的主要原料是高粱、大麥和豌豆：前者用于制造酒，后兩者用于制作曲[24]。高粱在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣是酒中糧食香的體現(xiàn)，異戊醇（麥芽香氣）在酒中作為糧食香氣的典型代表。β-苯乙醇（玫瑰和蜂蜜香氣）使得清香型白酒入口有甜的感覺。還有一些其它的研究工作報道1-戊醇、1-庚醇、2-庚醇和1-辛醇對白酒中的果香香氣有貢獻(xiàn)[23]。

酮類香氣化合物通常來自發(fā)酵過程中的脂質(zhì)和氨基酸的降解，并且它們對食物氣味具有高度影響[25]。宋波[26]在分析白酒中各種成分對白酒的影響時，指出丁二酮是白酒中不可缺少的成分，在優(yōu)質(zhì)白酒中含量一般為5～15 mg/100 mL，可增加香氣，有甜感，增加醇厚感。酸類物質(zhì)是形成酯類物質(zhì)的前提，它對各香氣成分起協(xié)調(diào)、平衡作用，增加醇厚感；是新酒老熟的有效催化劑；對香味有抑制和掩蔽作用。異戊酸，己酸和癸酸在清香型白酒中被鑒定，其中己酸被報道對濃香型白酒有助香作用[26]。其它文獻(xiàn)中報道異戊酸和己酸對白酒中的奶酪香氣有貢獻(xiàn)[27]。

范文來等[7]總結(jié)近些年清香型白酒的研究報道，發(fā)現(xiàn)β-大馬士酮、土味素等也是重要的香氣化合物，其中β-大馬士酮（蜂蜜和花香香氣）雖然

表1 5 種清香型白酒中香氣化合物的GC-O 鑒定Table 1 Aroma compounds identified by gas chromatography-olfactometry in five light aroma-type liquors

（續(xù)表1）

2.2 香氣物質(zhì)的定量分析和香氣活力值分析

由表2可知，采用建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法對表1中香氣強(qiáng)度值≥2 的35 種香氣化合物進(jìn)行定量分析。在這些香氣化合物中，乙酸乙酯在之前很多的研究中被認(rèn)為是白酒中含量最高的物質(zhì)。在國家標(biāo)準(zhǔn)中[31]，乙酸乙酯在優(yōu)級的清香型白酒中的含量大于1 g/L。在本次研究中，乙酸乙酯含量最高與之前的報道一致。其次，異戊醇在清香型白酒中濃度位居第2，由于發(fā)酵過程中，產(chǎn)生大量的異戊醇，另外，己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯以及異丁醇的含量也較高（1～100 mg/L）。同時，十六酸乙酯（97 mg/L）在金門高粱酒中有的濃度較高，而在其它4 種清香型白酒中未檢測出。β-大馬士酮（0.8～47.3 μg/L）在白酒中是痕量物質(zhì)，然而并不是含量越低，該物質(zhì)對酒的整體香氣貢獻(xiàn)度就越小，該物質(zhì)的香氣閾值大小也是重要因素之一，因此，基于這兩方面考慮，香氣活力值（OAV）的引入成為衡量某種香氣物質(zhì)對整體香氣貢獻(xiàn)度大小的重要指標(biāo)。一般來說[33]，OAV 值≥1 的香氣物質(zhì)被認(rèn)為是重要的香氣物質(zhì)。

由表3可知，由于β-大馬士酮的香氣閾值為0.12 μg/L，雖然定量濃度很小，但是它對于酒的整體香氣貢獻(xiàn)度依然排在前面，這與文獻(xiàn)報道的一致[7]。共有18 種香氣化合物的OAV 值≥1，這些物質(zhì)是酒中重要的香氣化合物。辛酸乙酯（白蘭地香氣）、己酸乙酯（菠蘿樣香氣）、異戊醛（令人愉快的果-香香氣）這3 種香氣化合物的OAV 值最高，均大于100，異戊醛（OAV 57-2929）具有青草香和麥芽香，被認(rèn)為是青稞酒中重要的香氣化合物之一[6]，含量雖然不到乙酸乙酯的十分之一，但是由于其較低的閾值（16.51 μg/L），所以在酒中的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)度大。并且己酸乙酯也是濃香型白酒種的特征香氣化合物[23]。辛酸乙酯（OAV=4 523）和己酸乙酯（OAV=2 041）在杏花村酒中貢獻(xiàn)度最大，因此杏花村酒被認(rèn)為是中國清香型白酒的代表。

2.3 感官評價分析

由表4的Duncan 多重比較分析可知，酸香和清香香韻在5 種酒中差異性極其顯著（P＜0.001）。國色清香酒在酸香和花香香韻中得分最低，而它的窖香香韻突出；紅星二鍋頭酒在糧香和清香中得分最低，而在酸香方面突出，因此在感官評測中香氣較為醇厚；杏花村和汾酒由于出自同一個地區(qū)，因此這兩種白酒大體相似，在甜香和果香方面得分最高，因此這兩種酒在嗅聞上比其它的酒偏果香和甜；金門高粱酒在糧香和清香香韻上得分很高，金門高粱酒來自臺灣金門酒廠，可能由于當(dāng)?shù)氐母吡慌c內(nèi)陸的高粱品種不同，導(dǎo)致金門高粱酒在糧香上有突出表現(xiàn)，因此金門高粱酒香氣更偏清香和糧食的香氣。

2.4 樣品、感官屬性和香氣物質(zhì)的相關(guān)性分析

PLSR 用于處理由小組成員的感官評價累積的平均值，氣味活性芳香化合物和樣品之間的相關(guān)性。X 代表白酒的香氣化合物；Y 代表感官變量和樣本。包括兩個重要主成分的PLSR 模型解釋了交叉驗(yàn)證方差的70%（圖1）。結(jié)果表明，PLSR模型中的最優(yōu)組分?jǐn)?shù)量被確定為兩個主要組分。PC2 對PC3 結(jié)果沒有在這里呈現(xiàn)，因?yàn)闆]有提供超出PC1-PC2 的有用相關(guān)性信息。圖中的小橢圓和大橢圓分別代表該模型50%和100%的解釋方差，從圖1可以看出，除了酸香和窖香兩個感官屬性外，其余感官屬性變量均分布在兩個橢圓之間。

通過PLSR 回歸分析，將樣品、感官屬性及香氣物質(zhì)相關(guān)聯(lián)，由圖1可知，國色清香與窖香香韻有相關(guān)性，并且國色清香與β-大馬士酮（56）呈現(xiàn)相關(guān)性；紅星二鍋頭酒與酸香香韻相關(guān)性較好，這與感官分析（表4）得到的結(jié)果相一致；杏花村酒和金門高粱酒與花香香韻和糧香香韻具有相關(guān)性，而花香和糧香香韻分別與異丁酸乙酯（3）、己酸乙酯（10）和辛酸乙酯（15）；汾酒與甜香、果香香韻相關(guān)，而且汾酒與異戊醇 （33）、苯丙酸乙酯（25）、壬醛（47）、乙酸苯乙酯（23）具有較好的相關(guān)性，這4 種香氣化合物也被認(rèn)為是汾酒中的重要香氣化合物質(zhì)[3]。

表2 5 種清香型白酒中香氣物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量濃度Table 2 Standard curves and mass concentrations of odorants in five light aroma-type liquors

表3 5 種清香型白酒中香氣化合物的閾值和香氣活力值Table 3 Thresholds and OAVs of aroma compounds in five light aroma type Chinese liquors

圖1 清香型白酒樣品、感官屬性與香氣化合物之間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation loading plot for samples，sensor evaluation and aroma compounds

3 結(jié)論

1） 通過HS-SPME-GC-MS 和GC-O 鑒定出72 種香氣化合物，其中35 種為活性香氣化合物（香氣強(qiáng)度值≥2）。清香型白酒中香氣物質(zhì)共分為8 類，包括酯類、醇類、醛類、酸類、酚類、酮類、烯烴類和其它類。

2） 通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線法對這35 種香氣活性化合物進(jìn)行定量分析，并結(jié)合OAV 計算，35 種香氣活性化合物中有18 種物質(zhì)OAV≥1。香氣強(qiáng)度評分≥2，且OAV≥1 的18 個香氣活性化合物按照OAV 值從大到小依次排序：辛酸乙酯、異戊醛、己酸乙酯、異戊酸乙酯、β-大馬士酮、乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、壬醛、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、異戊醇、異丁醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯。OAV值高的香氣物質(zhì)為清香型白酒整體香味貢獻(xiàn)出糧香、果香、花香、甜香等，它們綜合組成了清香型白酒的獨(dú)特香型特征。

3） 通過PLSR 相關(guān)性分析得到國色清香與清香香韻具有相關(guān)性，國色清香與窖香香韻有相關(guān)性，并且國色清香與β-大馬士酮呈相關(guān)性；紅星二鍋頭酒與酸香香韻相關(guān)性較好；杏花村酒和金門高粱酒與花香香韻和糧香香韻具有相關(guān)性，而花香和糧香香韻分別與異丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯；汾酒與甜香、果香香韻相關(guān)，而且汾酒與異戊醇、苯丙酸乙酯、壬醛、乙酸苯乙酯具有較好的相關(guān)性。