劉 歡 劉 文 楊 斯 韓東海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

牛肉的腐敗不僅會(huì)破壞感官質(zhì)量，引起不良風(fēng)味，甚至還會(huì)產(chǎn)生毒素，給人體健康造成危害，因此保證牛肉的新鮮度至關(guān)重要。常規(guī)的牛肉品質(zhì)檢測(cè)方法，主要包括：感官評(píng)價(jià)、微生物檢測(cè)、理化檢測(cè)等[1]。這些方法常具有人為主觀性強(qiáng)，缺少量化指標(biāo)，預(yù)處理操作繁瑣，需要大量試劑，檢測(cè)效率低，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)樣品破壞性大等缺點(diǎn)，難以滿足對(duì)牛肉新鮮度實(shí)時(shí)檢測(cè)的需要。

熒光光譜法是一種靈敏度高、檢測(cè)速度快的分析技術(shù)，儀器成本相對(duì)較低[2]。牛肉中含有多種可以產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，如色氨酸、酪氨酸、膠原質(zhì)以及核黃素等[3]。Yoshimura[4]使用三維熒光光譜結(jié)合PLS 回歸分析，預(yù)測(cè)牛肉表面的菌落總數(shù)。Skjervold[5]提出利用熒光成像技術(shù)區(qū)分肉中的脂肪組織、結(jié)締組織和肌纖維組織。Kim[6]根據(jù)雞胸肉表皮的熒光特征，鑒定雞肉是否存在疫病危害。Egelandsdal[7]利用熒光發(fā)射光譜測(cè)定了牛背最長(zhǎng)肌的嫩度。

表面熒光技術(shù)是采用固體樣品架，使激發(fā)光源和檢測(cè)器同在樣品一邊，互成45°，可以直接采集牛肉的光譜特征，不需要任何前處理，可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，避免有機(jī)溶劑污染[8]，具有簡(jiǎn)單、快速、非破壞、取樣量少、靈敏度高、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。

本研究使用表面熒光法對(duì)牛肉的新鮮度進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)，明確牛肉的熒光特性，確定牛肉中特征吸收峰的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，挖掘可作為牛肉新鮮度檢測(cè)指標(biāo)的熒光物質(zhì)，并建立牛肉新鮮度的判別分析模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛肉樣品（產(chǎn)地為日本青森縣和澳大利亞），日本京都GRACE 超市；檢測(cè)部位為牛肩肉。

1.2 儀器與設(shè)備

FP 8300 熒光分光光度計(jì)，JASCO日本分光株式會(huì)社；pH 計(jì)，日本SATO 佐藤；10～100 μL，100～1 000 μL 移液槍，日本NICHIRYO 立洋。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肉浸出液的制備 將樣品除去脂肪、結(jié)締組織、筋腱后剪碎，稱取10 g 置于燒杯中，加入預(yù)先煮沸并經(jīng)冷卻的蒸餾水100 mL，不時(shí)振搖，浸漬30 min 后過濾，濾液置于錐形瓶中備用。

1.3.2 樣品貯藏條件 牛肉樣品的貯藏溫度和時(shí)間如表1所示。

1.3.3 pH 值的測(cè)量 取待測(cè)肉樣5 g，絞碎，加入50 mL 蒸餾水，混勻，浸泡30 min 并不時(shí)攪拌，過濾，用pH 計(jì)測(cè)定濾液的pH 值。每次使用前先對(duì)pH 計(jì)進(jìn)行校正，再測(cè)定pH 值。

表1 牛肉樣品在4，15，25 ℃下的貯藏時(shí)間Table 1 Sampling points during storage monitoring for 4，15 ℃and 25 ℃

1.3.4 球蛋白沉淀試驗(yàn) 向試管中加入肉浸出液2 mL，加10%硫酸銅溶液5 滴，振蕩后靜置5 min后觀察，并做空白對(duì)照。

1.3.5 數(shù)據(jù)采集 將牛肉樣品放入表面熒光樣品架中，再放入熒光分光光度計(jì)中掃描。設(shè)定三維熒光光譜掃描條件：激發(fā)波長(zhǎng)Ex 的范圍200～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em 的范圍210～600 nm，掃描間隔5 nm，掃描速度30 000 nm/min。同步熒光掃描激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280～550 nm，固定波長(zhǎng)差△λ 值為75 nm。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次。

1.3.6 熒光圖譜的校正處理 由于不同的熒光光譜儀掃描相同的樣品所得到的熒光峰強(qiáng)度不同，即使是同一臺(tái)光譜儀，在使用過程中氙燈的能量會(huì)逐漸衰減，也會(huì)對(duì)樣品熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果造成影響[9]。因此，在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，應(yīng)該對(duì)熒光圖譜進(jìn)行校正。本研究采用一種基于水的拉曼散射的熒光圖譜校正方法。首先，在測(cè)量樣品光譜前，先測(cè)量蒸餾水在激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm 處的吸收峰，然后以水的拉曼散射強(qiáng)度為參比，對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正[10]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及軟件應(yīng)用 運(yùn)行SIMCA-P 11.5 中的偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）進(jìn)行定性分析；利用SPSS19.0 進(jìn)行聚類分析（CA）；利用Origin 8.5 作圖并進(jìn)行樣品的平滑及求導(dǎo)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉新鮮度的化學(xué)指標(biāo)分析

2.1.1 pH 值的變化分析 分別測(cè)量日本和澳大利亞牛肉在不同貯藏條件下肉浸出液的pH 值。

由圖1可以看出，日本與澳大利亞牛肉樣品的pH 值均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，這是由于肉腐敗分解時(shí)，蛋白質(zhì)分解為氨和有機(jī)胺類等堿性物質(zhì)，使pH 值上升[11]，因此pH 值在一定程度上可以表示肉的新鮮度。

相關(guān)研究表明，可以根據(jù)肉浸出液的pH 值對(duì)牛肉的新鮮程度大致分級(jí)：新鮮肉的pH 值為5.8～6.2，次級(jí)鮮肉的pH 值為6.3～6.7，變質(zhì)肉的pH 值在6.8 以上[12]。

圖1 牛肉樣品肉浸出液在4，15 ℃和25 ℃貯藏下的pH 值變化Fig.1 The change of pH value during storage for 4，15 ℃and 25 ℃

2.1.2 球蛋白沉淀試驗(yàn)分析 肌肉中的球蛋白在堿性條件下呈可溶解狀態(tài)，而酸性條件下不溶。新鮮肉呈酸性，因此肉浸出液中無(wú)球蛋白存在。而腐敗肉由于大量有機(jī)堿的生成而成堿性，肉浸液溶解有球蛋白，腐敗越嚴(yán)重，球蛋白的數(shù)量越多?？梢允褂肅uSO4溶液作為試劑，使Cu2+與被檢肉浸液中球蛋白結(jié)合形成沉淀來(lái)判斷牛肉的新鮮度[12]。

如表2所示，不同貯藏時(shí)間及溫度下牛肉球蛋白沉淀試驗(yàn)的結(jié)果差異顯著。新鮮肉、次鮮肉和變質(zhì)肉分別為淡藍(lán)色溶液、完全澄清，微弱藍(lán)色、輕度渾濁以及極度混濁、有白色沉淀。

表2 牛肉樣品肉浸出液在不同貯藏條件下的球蛋白沉淀結(jié)果Table 2 Results of globulin precipitation in meat extract of beef samples under different storage conditions

2.2 牛肉新鮮度的分級(jí)

根據(jù)2.1 節(jié)中牛肉樣品肉浸出液的pH 值以及球蛋白沉淀這兩個(gè)指標(biāo)，利用聚類分析（CA）的方法將所有牛肉樣品的新鮮度分為3 個(gè)等級(jí)：新鮮肉、次鮮肉和腐敗肉（圖2）。

圖2 牛肉樣品新鮮度分級(jí)的聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram in order to categorize beef freshness by clustering analysis

由圖2可知，聚類分析對(duì)牛肉的新鮮度進(jìn)行準(zhǔn)確分級(jí)，分級(jí)結(jié)果與肉浸出液的pH 值及球蛋白沉淀結(jié)果一致，此分級(jí)結(jié)果將作為接下來(lái)建立表面熒光定性模型的化學(xué)真值參照。

2.3 牛肉的表面熒光特性分析

由于脂肪組織和肌肉組織有完全不同的熒光特性，因此分別采集了瘦肉和肥肉的表面三維熒光光譜，三維熒光光譜是描述物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系譜圖，通過一次三維掃描，便有可能監(jiān)測(cè)體系中的全部熒光組分[13]。

由圖3可知，牛肉中每個(gè)熒光峰激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的位置（表3）。瘦肉組織的表面三維光譜共有兩個(gè)熒光特征峰，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的位置在Ex/Em：230 nm/330 nm 和Ex/Em：290 nm/330 nm，這兩個(gè)特征峰由色氨酸發(fā)熒光產(chǎn)生[14]。脂肪組織的表面三維光譜共有7 個(gè)特征峰，與瘦肉熒光光譜相同，位置在Ex/Em：230 nm/330 nm 和290 nm/330 nm 的特征峰由色氨酸發(fā)熒光產(chǎn)生；相關(guān)研究表明，發(fā)射波長(zhǎng)位于400 nm 附近，激發(fā)波長(zhǎng)介于300～350 nm 的特征吸收峰與維生素發(fā)熒光有關(guān)[15]，因此位置在Ex/Em：310 nm/390 nm 和Ex/Em：320 nm/390 nm 處的熒光峰由脂溶性維生素產(chǎn)生；在水中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的激發(fā)波長(zhǎng)在340 nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng)在450 nm 左右[16]，在牛肉中由于各組分之間的相互作用，會(huì)影響NADH 的特征峰位置，由此可推斷出位置在Ex/Em：310 nm/440 nm 和Ex/Em：320 nm/440 nm處的熒光峰由NADH 產(chǎn)生；Egelandsdal[17]研究指出位置在Ex/Em：350 nm/470 nm 處的熒光峰為膠原質(zhì)。綜上所述，牛肉的脂肪組織可以比瘦肉組織提供更全面的熒光物質(zhì)信息，因此選擇牛肉的脂肪組織作為研究對(duì)象，以檢測(cè)牛肉的新鮮度。

圖3 牛肉樣品三維熒光譜圖Fig.3 The 3-D fluorescence spectra of beef sample

表3 牛肉樣品中熒光物質(zhì)的特征峰位置Table 3 The characteristic peaks of fluorescent substances in beef

2.4 牛肉新鮮度的定性判別分析

在實(shí)際應(yīng)用中，三維熒光的分析方法較為復(fù)雜，運(yùn)算時(shí)間較長(zhǎng)，而同步熒光分析法具有簡(jiǎn)化圖譜，提高選擇性，減少光散射干擾等特點(diǎn)。在同步掃描時(shí)最常用的是恒波長(zhǎng)同步熒光法 （△λ=λem-λex=常數(shù)），混合物體系的三維熒光光譜可以從理論上預(yù)測(cè)同步掃描時(shí)的△λ 值[13]。根據(jù)牛肉三維圖譜中的各熒光物質(zhì)的特征峰位置可以推斷出，當(dāng)△λ=75 nm 時(shí)，能掃描到牛肉中3 種熒光物質(zhì)的光譜信息，可以較為全面的描述牛肉的熒光特征，因此本研究選擇△λ=75 nm 作為同步熒光掃描的固定波長(zhǎng)差。

共取78 個(gè)不同新鮮度的牛肉樣品（日本及澳大利亞牛肉樣品各39 個(gè)），分別采集各樣品固定波長(zhǎng)差△λ 為75 nm 的表面同步熒光光譜，將所有樣品的光譜按照大致3∶1 的比例，分成59 個(gè)校正集和19 個(gè)驗(yàn)證集。

圖4為所有牛肉樣品脂肪組織在固定波長(zhǎng)差△λ 為75 nm 的同步熒光掃描結(jié)果，一共掃描到4個(gè)特征峰。其中，脂肪組織固有3 個(gè)熒光特征峰，發(fā)射波長(zhǎng)位置分別為：302，348，391 nm，這3 個(gè)熒光峰分別由色氨酸與脂溶性維生素產(chǎn)生，不同新鮮度牛肉樣品之間的熒光峰強(qiáng)度存在較大差異。

與新鮮牛肉相比，經(jīng)過較高溫度或較長(zhǎng)時(shí)間貯藏的牛肉脂肪組織在發(fā)射波長(zhǎng)為462 nm 處產(chǎn)生了新的特征峰。研究表明，牛肉在貯藏時(shí)發(fā)生氧化的過程中，脂肪中的丙二醛（MA）加合物與氨基化合物會(huì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生能發(fā)熒光的共軛席夫堿（結(jié)構(gòu)為RN=CH-CH=CH-NHR），激發(fā)波長(zhǎng)位置大約在360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)大約在450 nm[18]，因此這個(gè)新的熒光峰是由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生。綜上所述，新鮮牛肉和腐敗牛肉在熒光光譜上有較大差異，證明了表面熒光法檢測(cè)牛肉新鮮度的可行性。

對(duì)牛肉樣品的原光譜進(jìn)行Savitzky-Golay 平滑（25，3）及二階導(dǎo)數(shù)處理，并以所得到的二階導(dǎo)數(shù)光譜的波長(zhǎng)點(diǎn)為X 變量，以2.2 節(jié)中牛肉樣品新鮮度的分級(jí)結(jié)果為Y 變量，進(jìn)行PLS-DA 判別分析。PLS-DA 是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，對(duì)量測(cè)矩陣進(jìn)行正交分解的同時(shí)對(duì)響應(yīng)矩陣也進(jìn)行正交分解，是一種基于特征變量的回歸方法[19]。

首先對(duì)59 個(gè)校正集樣本建立PLS-DA 識(shí)別模型，圖5顯示了校正集樣品的潛變量得分圖，從圖中可以看出該模型對(duì)牛肉的新鮮度等級(jí)做出了很好的區(qū)分，判別正確率可達(dá)96.61%。

為驗(yàn)證模型對(duì)未知樣本的適用性，將19 個(gè)驗(yàn)證集樣本作為未知樣本與校正集樣品一起建立PLS-DA 模型。由圖6可以看出，新鮮肉、次鮮肉和腐敗肉的判別結(jié)果基本與校正集樣本模型結(jié)果一致，僅存在1 個(gè)誤判，準(zhǔn)確率為94.44%。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有有效鑒定牛肉新鮮度的潛力。

圖4 不同貯藏條件下牛肉脂肪組織的表面同步熒光光譜圖（△λ=75 nm）Fig.4 The surface synchronous fluorescence spectra of beef fat during different storage conditions（△λ=75 nm）

圖5 校正集樣品PLS-DA 模型的潛變量得分圖Fig.5 The latent variable scores of validation samples by PLS-DA modeling

圖6 校正集和驗(yàn)證集樣品的PLS-DA 模型的潛變量得分圖Fig.6 The latent variable scores of validation and calibration samples by PLS-DA modeling

3 結(jié)論

本研究采用表面熒光技術(shù)開發(fā)了一種牛肉新鮮度檢測(cè)的新方法，牛肉貯藏過程中各熒光物質(zhì)強(qiáng)度的變化，以及脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的新的熒光物質(zhì)席夫堿可以作為牛肉新鮮度的檢測(cè)指標(biāo)，利用表面同步熒光光譜 （固定波長(zhǎng)差△λ 為75 nm）結(jié)合PLS-DA 法的牛肉新鮮程度定性判別模型對(duì)校正集及驗(yàn)證集樣品的檢測(cè)，均取得良好的效果，且牛肉的產(chǎn)地差別并不會(huì)對(duì)建模結(jié)果造成影響。該方法為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及便攜儀器的開發(fā)打下理論基礎(chǔ)，并且在其它肉品品質(zhì)檢測(cè)方面也具有一定的應(yīng)用前景。

致謝：感謝日本京都大學(xué)農(nóng)學(xué)部生物傳感實(shí)驗(yàn)室（近藤直教授研究室） 為本研究提供儀器支持。