李 棟 林俊芳，2， 劉 聰，2 葉志偉，2 郭麗瓊，2，* 云 帆 康林芝

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 食品生物技術(shù)研究所 廣州510642 2 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心 廣州510642 3 廣州市澳鍵豐澤生物科技股份有限公司 廣州510760）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）隸屬于子囊菌的蟲(chóng)草屬（Cordyceps），又名北冬蟲(chóng)夏草[1]，是在中國(guó)和一些亞洲國(guó)家廣泛分部的一種傳統(tǒng)食藥用菌，因具有多種生物學(xué)活性和生理功能[2]，同時(shí)易于人工培養(yǎng)獲得子實(shí)體[3]，而受到廣泛關(guān)注，對(duì)其主要活性物質(zhì)蟲(chóng)草素、真菌多糖已做大量研究[4]。早在2005年付鳴佳等[5]就證實(shí)藍(lán)光可以誘導(dǎo)蛹蟲(chóng)草菌絲體累積類(lèi)胡蘿卜素。2010年有報(bào)道[6]在蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中分離到葉黃素。2013年Dong 等[7]進(jìn)一步研究蛹蟲(chóng)草的類(lèi)胡蘿卜素，分離純化出4 種水溶性極好的類(lèi)胡蘿卜素，分別命名為北蟲(chóng)草黃素（Cordyxanthin）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，這4 種類(lèi)型的類(lèi)胡蘿卜素占到總含量的86.7%。作為迄今為止罕見(jiàn)的水溶性類(lèi)胡蘿卜素，其理論上具有更強(qiáng)的生理活性和應(yīng)用價(jià)值，然而蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑至今尚未闡明。

天然類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)分部最廣泛的色素，所有光合生物以及許多非光和細(xì)菌、真菌都能合成[7]。在過(guò)去的20年間，幾乎所有與類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑相關(guān)的酶都被鑒定出來(lái)[8]。通過(guò)對(duì)主要合成途徑的考察發(fā)現(xiàn)：類(lèi)胡蘿卜素是含有C40骨架并有多至15 個(gè)共軛雙鍵的異戊二烯化合物[9]。以類(lèi)胡蘿卜素為前體進(jìn)行裂解而獲得更短鏈的脫輔基類(lèi)胡蘿卜素（apocarotenoid），是普遍的合成機(jī)制[10]。1997年第1 個(gè)涉及類(lèi)胡蘿卜素裂解氧化酶的成員VP14 酶被分離鑒定出來(lái)，隨后，一個(gè)能裂解不同類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生脫輔基類(lèi)胡蘿卜素的酶家族，稱(chēng)為類(lèi)胡蘿卜素裂解氧化酶（Carotenoid Cleavage Oxygenase，CCOs）被鑒定[11]。該家族的酶從多種植物中分離[12-13]，而蛹蟲(chóng)草中的CCD 酶基因還未見(jiàn)報(bào)道[14]。本研究從蛹蟲(chóng)草中克隆該基因，分析其序列和表達(dá)，為全面解析蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒 蛹蟲(chóng)草菌種（Cordyceps militaris CM04）菌株、大腸桿菌DH5α，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究所；克隆載體pGEM-T，美國(guó)Promega 公司。

1.1.2 試 劑 和 試 劑 盒 Ex Taq 酶、dNTPs、T4 DNA 連接酶，大連寶生物公司；Fungal RNA Kit，美國(guó)OMEGA 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit （with gDNase）、熒光定量預(yù)混液SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司；PCR 引物合成和測(cè)序由廣州吉美生物科技有限公司完成，其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取 取0.5 g 菌絲用液氮法粉碎，將粉末轉(zhuǎn)入800 μL（68 ℃）的FDEB Buffer 混勻溫育30 min，后加300 μL 3 mol/L KAc（pH 5.2），輕輕混勻，并于20 min，4 ℃，12 000 r/min 離心6 min，上清液轉(zhuǎn)移至新管；加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）混勻，4 ℃，12 000 r/min 離心6 min，上清液轉(zhuǎn)移至新管加0.6 倍體積異丙醇混勻，-20 ℃靜置30 min，12 000 r/min 離心6 min 棄去上清，沉淀用70%乙醇洗2 次，真空干燥，沉淀用ddH2O 溶解-20 ℃保藏待用。

1.2.2 全長(zhǎng)基因克隆及測(cè)序 從NCBI 上下載已公布的蛹蟲(chóng)草基因組序列，采用GeneScan 軟件從頭基因預(yù)測(cè)，建立本地BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)，下載典型的CCD 酶水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）圓酵母素加氧酶（Torulene oxygenase）基因cao-2 進(jìn)行本地比對(duì)[15]，找到蛹蟲(chóng)草中高度同源的基因，利用Primer5.0 軟 件 設(shè) 計(jì)5'CarT-F （5'-ATGGCACT CAACGGCCCGGGTA-3'）和3'CarT-R（5'-TCACAGCTGGCTCTGGTAATGTCCATGAA-3'）擴(kuò)增引物。用此引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，純化后鏈接到pGEM-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑篩選法選取陽(yáng)性克隆，鑒定正確后送廣州美吉生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析 利用NCBI BLAST 進(jìn)行相似性比對(duì)，ORF finder 確定開(kāi)放閱讀框架。運(yùn)用DNAStar 軟件分析氨基酸序列、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，核酸及蛋白序列同源比對(duì)在NCBI BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行，使用DNAStar 軟件包進(jìn)行基因格式編輯和翻譯，使用Prot-Param（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行一級(jí)結(jié) 構(gòu) 分 析 、ProtScale （http：//web.expasy.org/protscale/） 進(jìn)行親疏水性分析、SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 分析其信號(hào)肽和亞 細(xì) 胞 定 位、ProteinPredict（https：//www.predictprotein.org/） 進(jìn) 行 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測(cè)、COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分 析卷曲螺旋區(qū)段、Pfam（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域分析、InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）檢索其特征結(jié)構(gòu)域，ExPaSy（http：//www.expasy.org/proteomics）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，應(yīng)用MAGA 6.06 進(jìn)行本地建樹(shù)，多重序列比對(duì)采用ClustalX 完成。

1.2.4 總RNA 提取 取新鮮菌絲50 mg，用液氮法粉碎至于1.5 mL 離心管中，按照天根公司所提供的真菌RNA 小量提取試劑盒R6840 的步驟提取總RNA。

1.2.5 單鏈cDNA 的合成 cDNA 第一鏈的獲得利用天根公司Fast Quant RT Kit （with gDNase）試劑盒，5×gDNA Buffer 2 μL 和Total RNA 2 μL混合，用RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL，42 ℃，孵育3 min，去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄體系包含10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme 1 μL，F(xiàn)QRT Primer Mix 2 μL，添加ddH2O 到10 μL 42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min 后冰浴，所得cDNA待用。

1.2.6 定量表達(dá)分析 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，以car-TC 全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性正反向引物：Car -Trna -F （5' -GACCGCAAACCTACAGAACAG-3'） 和Car-Trna-R （5'- TACCCCAGAGGCTCAAGAGT-3'）。以fef1 基因作為內(nèi)參，按照SYBR Green 試劑盒要求在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃15 min；95 ℃10 s；60 ℃32 s；72 ℃45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 car-TC 基因的克隆

提取蛹蟲(chóng)草CM04 的總DNA，以CarT-F 和CarT-R 為正反向引物擴(kuò)增靶序列，通過(guò)凝膠電泳，得到的PCR 產(chǎn)物為一條約1 700 bp 的片段，結(jié)果如圖1，其片段的大小和預(yù)測(cè)結(jié)果相符，擴(kuò)增特異性好，純度高。

2.2 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收PCR 產(chǎn)物，連接pGEM-T 克隆載體，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆菌落，搖菌過(guò)夜，進(jìn)行菌液PCR 鑒定，電泳結(jié)果中條帶清晰（圖2），插入片段約1 700 bp，取1，2，3 保種后送廣州美吉生物測(cè)序。

圖1 car-TC 基因的PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of amplified car-TC gene

圖2 pGEM-car-TC 重組質(zhì)粒PCR 驗(yàn)證Fig.2 Electrophoresis detection of pGEM-car-TC gene amplified

2.3 car-TC 基因和蛋白序列的分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對(duì)，該基因被NCBI 登錄的蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris CM01 dioxygenase，putative （CCM_06728），partial mRNA 基因覆蓋，覆蓋率達(dá)到84.6%，覆蓋區(qū)段完全相同。在線(xiàn)進(jìn)行ORF 查找，閱讀框架1 734 bp，應(yīng)用DNAStar 軟件包翻譯成氨基酸序列，在線(xiàn)提交ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析。得出該基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征：氨基酸殘基總數(shù)577 個(gè)，分子質(zhì)量64.8 ku，理論等電點(diǎn)5.82，分子式C2892H4437N801O874S12，總原子數(shù)量為9 046，不穩(wěn)定系數(shù)為35.55，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，理論半衰期大于20 h （在酵母，真菌體內(nèi)）。脂肪族系數(shù)71.96。在ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在線(xiàn)分析，平均親水性-0.574，為親水蛋白，符合其在水溶液中起催化作用的特性，與其定位于有色體基質(zhì)相符合。

2.3.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析和亞細(xì)胞定位 應(yīng)用SignalP4.1 在線(xiàn)分析其信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位。由信號(hào)肽分析圖譜可見(jiàn)，C 值最高值為0.110，表明無(wú)剪切位點(diǎn)，S 值最大為0.118，表明該蛋白不含信號(hào)肽，S-mean=0.100，該蛋白屬于非分泌蛋白。應(yīng)用TMHMM Server 2.0 在線(xiàn)分析跨膜螺旋結(jié)果顯示該蛋白序列不含有跨膜區(qū)域。同樣的結(jié)果也在Protein Predict 得到證明，該蛋白定位于有色體基質(zhì)。

2.3.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 氨基酸序列在線(xiàn)提交ProteinPredict，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)以卷曲為主，占到了73.14%，其次為β-折疊占23.05%，α-螺旋最少，為3.81%。

2.3.4 結(jié)構(gòu)域和超家族 應(yīng)用NCBI BLAST 分析其保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白具有視網(wǎng)膜上皮色素膜蛋白（Retinal pigment epithelial membrane proein）的典型結(jié)構(gòu)域RPE65，該結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)422aa。在InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）中檢索，其登入號(hào)為IPR004294。該酶屬于類(lèi)胡蘿卜素裂解氧化酶家族，該家族代表在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的膜上皮細(xì)胞受體的一類(lèi)蛋白，同時(shí)，該家族還包含了在很多光合和非光合的植物和真菌體內(nèi)的類(lèi)胡蘿卜素β-雙加氧裂解酶。含有一個(gè)特征結(jié)構(gòu)域。

2.3.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 將翻譯的氨基酸序列在線(xiàn)提交 ExPaSy （http：//www.expasy.org/proteomics），進(jìn)行同源建模，對(duì)蛹蟲(chóng)草CCD 酶蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，通過(guò)比對(duì)，該酶與多種已知結(jié)構(gòu)的RPE65 家族的酶類(lèi)高度同源，多種建模方式表明，該酶以單體形式完成催化反應(yīng)（Matching prediction）。

選擇可信度最好的4zhk.1.A 模型建模，該模型包含RPE65 典型結(jié)構(gòu)域，覆蓋率達(dá)到0.84，認(rèn)為接近試驗(yàn)數(shù)據(jù)，評(píng)分0.65，預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示?？梢?jiàn)其包含了CCD 催化活性所必須的4個(gè)保守的組氨酸殘基（HIS236、His288、His358、His570），這4 個(gè)組氨酸聚集在由β-折疊構(gòu)成的螺旋槳形三維結(jié)構(gòu)的軸線(xiàn)附近，可以結(jié)合催化活性所需要的非血紅素形式的亞鐵離子。

2.3.6 多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建選取已有報(bào)道的真菌源CCD 基因，以粗糙鏈孢菌（Neurospora_crassa） 的類(lèi)胡蘿卜素裂解氧化酶（CCO）為外群，運(yùn)用ClustalX 進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用MAGA6.06 軟件，按照鄰接法 （neighbor-joining，NJ）建樹(shù)，bootstrap=1 000[16]。結(jié)果見(jiàn)圖4。分支上的數(shù)字代表該分支的可靠性。

圖3 蛹蟲(chóng)草CCD 酶的三維結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary dimensional structure of CCD enzyme of Cordyceps militaris

圖4 蛹蟲(chóng)草CCDs 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of CCDs amino acid sequence

通過(guò)ClustalX 對(duì)該蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)并建樹(shù)。與相關(guān)研究結(jié)果[17]一致，不同物種乃至成員之間的CCDs 基因的氨基酸序列差距較大，然而序列中結(jié)合亞鐵離子的4 個(gè)組氨酸位點(diǎn)高度保守。

2.4 表達(dá)量差異

從圖5中可以看出，在白色菌絲階段，car-TC基因的表達(dá)量最高，且與其它生長(zhǎng)階段的表達(dá)量有顯著差異?？傮w而言，表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)。

圖5 car-TC 基因隨生長(zhǎng)階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Transcription level of car-TC genes in different growth stage

3 討論

隨著分離提純技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物活性成分被鑒定出來(lái)，其中類(lèi)胡蘿卜素獨(dú)特的雙鍵系統(tǒng)賦予其很多優(yōu)良的性質(zhì)，如抗氧化，抗腫瘤等。其中，蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素因其具有良好的水溶性，而引起人們的注意。蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素中的北蟲(chóng)草黃素是一種脫輔基類(lèi)胡蘿卜素，在所有報(bào)道的生物中，脫輔基類(lèi)胡蘿卜素的合成都是由含有非血紅素Fe2+的酶催化的，被鑒定為類(lèi)胡蘿卜素氧化裂解酶（CCDs），該酶廣泛的分部在動(dòng)物、植物、微生物等物種中，在水稻惡苗病菌（Fusarium.fujikuroi）中催化番茄紅素氧化裂解為鏈孢霉黃素（neurosporaxanthin） 的酶揭示了該類(lèi)酶在子囊菌類(lèi)胡蘿卜素合成中的功用[18]。

隨著apocarotenoid-15'，15'-oxygenase （ACO）的三維結(jié)構(gòu)被測(cè)定[19]，CCDs 序列和結(jié)構(gòu)有廣泛的共性：CCDs 的三維結(jié)構(gòu)是由β-折疊組成的螺旋槳形結(jié)構(gòu)，在螺旋槳的中軸線(xiàn)上有通過(guò)保守的組氨酸殘基結(jié)合活性中心Fe2+，可以通過(guò)活化分子氧，將氧插入雙鍵之間造成雙鍵斷裂，已有研究證明將氧分子的兩個(gè)氧原子同時(shí)加在斷裂的碳鏈兩端的雙加氧催化過(guò)程是雙鍵裂解酶的普遍特征[20]。通過(guò)對(duì)保守區(qū)域的比對(duì)和三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，可以看出克隆到的基因即是一個(gè)CCD 酶基因，該基因所編碼的酶的結(jié)構(gòu)和功能還有待進(jìn)一步研究，本研究為闡明蛹蟲(chóng)草類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中克隆了一個(gè)car-TC 基因，長(zhǎng)1 784 bp，包含一個(gè)RPE65 特征結(jié)構(gòu)域并含有CCD 保守的4 個(gè)組氨酸殘基起到結(jié)合催化中心鐵離子的作用，定位于有色體基質(zhì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析表明其表達(dá)量隨著生長(zhǎng)階段的進(jìn)行有下降的趨勢(shì)，在白色菌絲中表達(dá)量最高，推測(cè)是產(chǎn)物積累對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生的抑制，其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步考察。