王向陽 顧 雙

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018）

蔬菜衰老劣變過程中，膜脂質過氧化程度增加，膜的完整性受到破壞，表現(xiàn)出膜的透性增大，離子滲漏[1]。目前通常采用測定電導率來表示離子滲漏和膜透性情況[2-4]。儀器價格便宜，操作方法簡單，依據(jù)是離子從細胞內滲漏的原理。然而，植物中的一些離子存在于細胞間隙，細胞外濃度可能顯著高于細胞內濃度，測定電導率無法辨別是離子滲出，膜內滲出，還是細胞壁離子擴散所致，其滲透和擴散比例不清楚，無法確定是否會影響所測定的相對電導率的準確性。果蔬在水中浸泡多長時間后測定電導率，各種文獻報道差異很大，常見的有浸泡0.5 h 或1 h 后測定，也有浸泡更長或更短時間[5-8]。蔬菜作為人們生活中的主要副食，是礦物質營養(yǎng)元素的重要來源之一[9]，而礦物質是電導的主要成分，鉀、氯、鈉、鈣等是蔬菜的主要離子，目前學者主要利用離子選擇電極測定果蔬的一些離子含量。Harker 等[10]采用鈣離子選擇電極測定蘋果細胞內和細胞外的鈣離子含量；David等[11]利用鈣離子選擇電極測定蘋果果實中的鈣含量，發(fā)現(xiàn)此方法可用來檢測果實中低鈣的臨界水平。戴自飲等[12]用氯離子選擇性電極測量生菜、菠菜等27 種果蔬中的氯離子含量，與化學測量氯離子含量方法相比較，結果基本一致，避免了化學測定氯離子使用汞試劑，可以使實驗人員更加安全，并減少環(huán)境污染，然而使用離子選擇電極法測定蔬菜中的離子溶出濃度并不多見。本試驗以青菜為代表，使用這些離子檢測電極探究青菜衰老過程中主要離子的滲透和擴散過程，有助于了解和完善電導率測定方法，以期獲得比電導率更精確的方法，用于衰老和逆境等的研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

青菜：品種為“上海青”，當?shù)厍宄坎墒眨皶r運回實驗室。青菜從外向內數(shù)第1，2 片葉子為外葉，試驗采用外葉。

離子強度調節(jié)劑：K+、Ca2+、Na+、Cl-強度調節(jié)劑分 別 為1 mol/L MgAc2，0.1 mol/L KCl，0.2 mol/L二異丙胺和0.1 mol/L KNO3，試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

電子天平（AY－120），日本Shimadzu 公司；自動滴定儀（ZDJ-5 型）、鉀離子電極（PK-1-01 型）、鈣離子電極（PCa-1-01 型）、鈉離子電極（6801-01型）、氯離子電極（PCl-1-01 型）、甘汞雙鹽橋參比電極（217 型）、甘汞參比電極（232-01 型）、甘汞參比電極（6802-01 型）、硫酸亞汞參比電極[C（K2SO4）-1 型]，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

將青菜葉片去梗剪成細長條狀，稱取1.0 g，放在玻璃培養(yǎng)皿中視為1 份樣品，按同樣方法準備45 份樣品分裝于聚乙烯薄膜袋中貯藏，袋上扎有均勻小孔，編號后常溫（25±2）℃貯藏。貯藏0，3，7 d 取樣，分別測定1 h 內電導率，K+、Ca2+、Na+和Cl-的變化曲線。測定K+、Ca2+、Cl-前，均加入0.05 mL的離子調節(jié)劑。測定Na+前，將溶液pH 值用0.2 mol/L 二異丙胺調至10，以消除H+對電極的干擾。每種指標測定3 次重復，取平均值。

1.4 測定方法

1.4.1 標準曲線的繪制 分別用 KCl、CaCl2、NaCl 標準溶液配成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5mol/L濃度梯度，由稀到濃分別測試離子電極電位，根據(jù)電位值（mV）和離子濃度的負對數(shù)值（pX）繪制電極“mV-pX”標準曲線，結果如圖1。

圖1 K+、Ca2+、Na+、Cl-標準曲線Fig.1 Standard curves of K+，Ca2+，Na+ and Cl-

1.4.2 電導率測定 在測量杯中放入50 mL 去離子水，將1.0 g 樣品放入杯中測定1 h 內電導率，每隔20 s 讀數(shù)1 次。

1.4.3 鉀、鈣、鈉、氯離子濃度測定 在測量杯中放入50 mL 去離子水，取0，3，7 d 各1.0 g 樣品放入杯中，轉子速度為60 r/min，測定樣品1 h 內K+、Ca2+、Na+、Cl-溶出電位，每隔20 s 讀數(shù)記錄，通過標準曲線換算得到離子溶出量，計算公式如下：

離子溶出量（mg/g FW）=（10-X×M×V）/m

式中，X——電位對應標準曲線上的摩爾濃度負對數(shù)值；M——摩爾質量，g/mol；V——溶液體積，mL；m——樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 青菜外葉在水中電導率變化

貯藏0 d 的青菜在流動水中1 min 的電導率很低，而貯藏3 d 的青菜電導率顯著高于0 d，貯藏7 d 的青菜電導率顯著高于3 d。然而2 min 后，貯藏3 d 的青菜電導率快速上升，高于貯藏7 d 和0 d 的青菜（圖2a）。電導率與青菜衰老程度不相符，這情況一致持續(xù)到1 160 s。此后，貯藏7 d 的青菜電導率大于3 d，貯藏3 d 的青菜電導率大于0 d，符合衰老越嚴重，細胞膜滲透越大的特性。不同衰老青菜在流動水中30～60 min 的電導率基本平行上升，電導率與衰老之間顯示了較好的相關性，這區(qū)段可以用于測定青菜的相對電導率（圖2b）。李沖偉等[13]報道乙醇引起電導率下降，陽離子和質子上升引起電導率上升，而本研究幾乎沒有乙醇產生，預試驗發(fā)現(xiàn)不同衰老程度青菜溶出pH 值之間沒有顯著變化。陳年等[14]報道果汁中固形物含量、溫度對電導率有影響，如果添加少量氯化鈉，后者引起電導率上升遠遠大于前者。因此針對電導率的異常，應該主要測定青菜離子溶出情況。

圖2 不同衰老階段青菜電導率的變化Fig.2 Variation of conductivity of pak choys at different stages of senescence

2.2 青菜在水中鉀、鈣、鈉、氯離子溶出量的變化

在浸泡1 h 時，衰老青菜的Cl-和K+溶出量顯著多于Na+、Ca2+溶出量，前兩者對衰老青菜電導率變化貢獻較大。對于新鮮青菜，K+的溶出量對電導率所做貢獻最大，而對于新鮮青菜初始5 min 電導率是Na+溶出貢獻最大。見圖3、圖4。

貯藏0 d 青菜K+在開始20 s 沒有快速溶出，說明細胞外葉K+含量少，其溶出主要與膜滲透有關。放置0，3，7 d 青菜在前20 s 的K+溶出量幾乎一樣，說明青菜衰老過程，K+基本沒有滲漏到細胞外。然而，20 s 至440 s 時，貯藏3 d 青菜的K+溶出量顯著高于7 d，K+溶出和青菜衰老程度不相符，而與同期電導率反常一致，是電導率反常的一個內在原因。此后，貯藏7 d 青菜的K+溶出量持續(xù)高于3 d。貯藏7 d 和3 d 青菜K+溶出量在30 min 左右達到高點，而0 d 青菜的K+在50 min 左右才達到高點，說明衰老青菜K+細胞膜滲出加快，總滲出量也增加。見圖3a、圖4a。

貯藏0 d 青菜Ca2+在開始20 s 快速溶出達到0.041 mg/g，貯藏3 d 青菜Ca2+溶出量低于0 d，而貯藏7 d 青菜Ca2+溶出量遠遠高于0 d，且貯藏7 d 青菜鈣離子在20～40 s 還持續(xù)快速溶出，隨后不同衰老青菜都呈緩慢線性上升或平移。貯藏7 d青菜Ca2+溶出量遠高于對照，對照也遠高于3 d 青菜溶出量。Ca2+主要存在于細胞外，一般認為比細胞內胞質中鈣離子濃度高1 000 倍[15-16]。鈣與細胞壁中膠層的果膠質結合形成果膠鈣[17]，果膠鈣通過粘結植物細胞壁物質影響細胞壁的剛性，細胞壁結構和組分的變化是造成果實軟化的重要因素[18]。3 d Ca2+初期溶出慢，低于7 d 和0 d 青菜溶出量，可能與細胞壁中原果膠轉化為果膠酸有關，果膠酸比原果膠具有更強的結合鈣離子能力。在果蔬衰老過程中細胞壁的原果膠會轉化為果膠酸，進一步降解成半乳糖。貯藏7 d 青菜Ca2+在初期快速溶出，其值遠高于0 d，可能與此時果膠酸降解有關，大分子降解會導致細胞壁結合態(tài)的Ca2+在初期容易擴散出來。不同衰老程度青菜Ca2+的溶出量下降和上升特別顯著，有望作為細胞壁變化的一個快速檢測指標。見圖3b、圖4b。

圖3 添加不同衰老階段青菜的去離子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-變化（5 min）Fig.3 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 5 min

貯藏0 d 青菜Na+在開始20 s 溶出量達到0.125 mg/g，隨后基本沒有上升，說明開始20 s 內快速溶出的Na+存在于細胞外，其本質是細胞外擴散。而此后青菜細胞內的Na+溶出速度較慢，其本質是通過膜滲透。貯藏7 d 青菜Na+在開始20 s 內溶出量高于3 d，而3 d 青菜Na+在開始20 s 內溶出量高于0 d，20～40 s 是轉換期，此后溶出速度變慢，說明青菜衰老過程細胞可能滲漏少量Na+，并積累在細胞間。從1 h 圖來看，貯藏7 d 青菜Na+溶出量在初期和后期都高于3 d 溶出量，而在240～1 520 s 時，貯藏3 d 青菜Na+溶出速度反而高于7 d 青菜，這可能也是造成貯藏3 d 青菜的電導率在前20 min 反常的原因。貯藏3 d 青菜Na+溶出速度始終遠遠高于0 d（1 h）。見圖3c、圖4c。

貯藏0 d 青菜Cl-在開始20 s 并沒有快速溶出，只比隨后溶出稍快一點。貯藏0，3，7 d 青菜Cl-在開始20 s 時溶出量基本一樣（圖3d）。根據(jù)圖3d的溶出試驗，認為青菜中Cl-主要存在于細胞內，主要依靠滲透溶出。貯藏7 d 青菜Cl-溶出量高于3 d，且高于0 d。Cl-溶出量與衰老相符性好，Cl-溶出曲線呈3 條線性射線，新鮮青菜和中等衰老青菜的Cl-區(qū)分度高，而中等衰老和嚴重衰老青菜之間Cl-溶出區(qū)分度較差。見圖3d、圖4d。

3 結論

測定青菜電導率能較好反映其與衰老的相關性，然而浸泡前期電導率與衰老相符性差，測定青菜相對電導率需要流動水浸泡30～60 min。Cl-和K+是4 種離子中溶出量較多的離子，Na+、Ca2+溶出量相對較少。Na+和K+前期溶出與衰老相符性較差，可能是造成電導率前期與衰老相符性較差的原因。

圖4 添加不同衰老階段青菜的去離子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-變化（1 h）Fig.4 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 1 h

青菜細胞外Na+和Ca2+濃度顯著高于細胞內，初期溶出以擴散為主，此后兩種離子溶出速度較慢，該溶出是以滲透為主，青菜衰老過程細胞可能滲漏了少量Na+，并積累在細胞間。青菜Ca2+溶出的反常現(xiàn)象與細胞壁中果膠物質轉化和降解有關，未來可以通過建立兩者相關性，測定Ca2+溶出變化來快速了解衰老和逆境下細胞壁完好性，特別是其主要成分果膠的變化。絕大多數(shù)Cl-和K+主要存在于細胞內，細胞外含量很少，其主要依靠滲透溶出，衰老過程青菜基本沒有向細胞外滲漏并積累Cl-和K+。該兩種離子主要從細胞內溶出，測定Cl-和K+濃度能判斷衰老和逆境下細胞膜完好程度。