王向陽 顧 雙

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

蔬菜衰老劣變過程中，膜脂質(zhì)過氧化程度增加，膜的完整性受到破壞，表現(xiàn)出膜的透性增大，離子滲漏[1]。目前通常采用測(cè)定電導(dǎo)率來表示離子滲漏和膜透性情況[2-4]。儀器價(jià)格便宜，操作方法簡單，依據(jù)是離子從細(xì)胞內(nèi)滲漏的原理。然而，植物中的一些離子存在于細(xì)胞間隙，細(xì)胞外濃度可能顯著高于細(xì)胞內(nèi)濃度，測(cè)定電導(dǎo)率無法辨別是離子滲出，膜內(nèi)滲出，還是細(xì)胞壁離子擴(kuò)散所致，其滲透和擴(kuò)散比例不清楚，無法確定是否會(huì)影響所測(cè)定的相對(duì)電導(dǎo)率的準(zhǔn)確性。果蔬在水中浸泡多長時(shí)間后測(cè)定電導(dǎo)率，各種文獻(xiàn)報(bào)道差異很大，常見的有浸泡0.5 h 或1 h 后測(cè)定，也有浸泡更長或更短時(shí)間[5-8]。蔬菜作為人們生活中的主要副食，是礦物質(zhì)營養(yǎng)元素的重要來源之一[9]，而礦物質(zhì)是電導(dǎo)的主要成分，鉀、氯、鈉、鈣等是蔬菜的主要離子，目前學(xué)者主要利用離子選擇電極測(cè)定果蔬的一些離子含量。Harker 等[10]采用鈣離子選擇電極測(cè)定蘋果細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的鈣離子含量；David等[11]利用鈣離子選擇電極測(cè)定蘋果果實(shí)中的鈣含量，發(fā)現(xiàn)此方法可用來檢測(cè)果實(shí)中低鈣的臨界水平。戴自飲等[12]用氯離子選擇性電極測(cè)量生菜、菠菜等27 種果蔬中的氯離子含量，與化學(xué)測(cè)量氯離子含量方法相比較，結(jié)果基本一致，避免了化學(xué)測(cè)定氯離子使用汞試劑，可以使實(shí)驗(yàn)人員更加安全，并減少環(huán)境污染，然而使用離子選擇電極法測(cè)定蔬菜中的離子溶出濃度并不多見。本試驗(yàn)以青菜為代表，使用這些離子檢測(cè)電極探究青菜衰老過程中主要離子的滲透和擴(kuò)散過程，有助于了解和完善電導(dǎo)率測(cè)定方法，以期獲得比電導(dǎo)率更精確的方法，用于衰老和逆境等的研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

青菜：品種為“上海青”，當(dāng)?shù)厍宄坎墒?，及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。青菜從外向內(nèi)數(shù)第1，2 片葉子為外葉，試驗(yàn)采用外葉。

離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑：K+、Ca2+、Na+、Cl-強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑分 別 為1 mol/L MgAc2，0.1 mol/L KCl，0.2 mol/L二異丙胺和0.1 mol/L KNO3，試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（AY－120），日本Shimadzu 公司；自動(dòng)滴定儀（ZDJ-5 型）、鉀離子電極（PK-1-01 型）、鈣離子電極（PCa-1-01 型）、鈉離子電極（6801-01型）、氯離子電極（PCl-1-01 型）、甘汞雙鹽橋參比電極（217 型）、甘汞參比電極（232-01 型）、甘汞參比電極（6802-01 型）、硫酸亞汞參比電極[C（K2SO4）-1 型]，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將青菜葉片去梗剪成細(xì)長條狀，稱取1.0 g，放在玻璃培養(yǎng)皿中視為1 份樣品，按同樣方法準(zhǔn)備45 份樣品分裝于聚乙烯薄膜袋中貯藏，袋上扎有均勻小孔，編號(hào)后常溫（25±2）℃貯藏。貯藏0，3，7 d 取樣，分別測(cè)定1 h 內(nèi)電導(dǎo)率，K+、Ca2+、Na+和Cl-的變化曲線。測(cè)定K+、Ca2+、Cl-前，均加入0.05 mL的離子調(diào)節(jié)劑。測(cè)定Na+前，將溶液pH 值用0.2 mol/L 二異丙胺調(diào)至10，以消除H+對(duì)電極的干擾。每種指標(biāo)測(cè)定3 次重復(fù)，取平均值。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別用 KCl、CaCl2、NaCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液配成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5mol/L濃度梯度，由稀到濃分別測(cè)試離子電極電位，根據(jù)電位值（mV）和離子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值（pX）繪制電極“mV-pX”標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1。

圖1 K+、Ca2+、Na+、Cl-標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of K+，Ca2+，Na+ and Cl-

1.4.2 電導(dǎo)率測(cè)定 在測(cè)量杯中放入50 mL 去離子水，將1.0 g 樣品放入杯中測(cè)定1 h 內(nèi)電導(dǎo)率，每隔20 s 讀數(shù)1 次。

1.4.3 鉀、鈣、鈉、氯離子濃度測(cè)定 在測(cè)量杯中放入50 mL 去離子水，取0，3，7 d 各1.0 g 樣品放入杯中，轉(zhuǎn)子速度為60 r/min，測(cè)定樣品1 h 內(nèi)K+、Ca2+、Na+、Cl-溶出電位，每隔20 s 讀數(shù)記錄，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到離子溶出量，計(jì)算公式如下：

離子溶出量（mg/g FW）=（10-X×M×V）/m

式中，X——電位對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的摩爾濃度負(fù)對(duì)數(shù)值；M——摩爾質(zhì)量，g/mol；V——溶液體積，mL；m——樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 青菜外葉在水中電導(dǎo)率變化

貯藏0 d 的青菜在流動(dòng)水中1 min 的電導(dǎo)率很低，而貯藏3 d 的青菜電導(dǎo)率顯著高于0 d，貯藏7 d 的青菜電導(dǎo)率顯著高于3 d。然而2 min 后，貯藏3 d 的青菜電導(dǎo)率快速上升，高于貯藏7 d 和0 d 的青菜（圖2a）。電導(dǎo)率與青菜衰老程度不相符，這情況一致持續(xù)到1 160 s。此后，貯藏7 d 的青菜電導(dǎo)率大于3 d，貯藏3 d 的青菜電導(dǎo)率大于0 d，符合衰老越嚴(yán)重，細(xì)胞膜滲透越大的特性。不同衰老青菜在流動(dòng)水中30～60 min 的電導(dǎo)率基本平行上升，電導(dǎo)率與衰老之間顯示了較好的相關(guān)性，這區(qū)段可以用于測(cè)定青菜的相對(duì)電導(dǎo)率（圖2b）。李沖偉等[13]報(bào)道乙醇引起電導(dǎo)率下降，陽離子和質(zhì)子上升引起電導(dǎo)率上升，而本研究幾乎沒有乙醇產(chǎn)生，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同衰老程度青菜溶出pH 值之間沒有顯著變化。陳年等[14]報(bào)道果汁中固形物含量、溫度對(duì)電導(dǎo)率有影響，如果添加少量氯化鈉，后者引起電導(dǎo)率上升遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者。因此針對(duì)電導(dǎo)率的異常，應(yīng)該主要測(cè)定青菜離子溶出情況。

圖2 不同衰老階段青菜電導(dǎo)率的變化Fig.2 Variation of conductivity of pak choys at different stages of senescence

2.2 青菜在水中鉀、鈣、鈉、氯離子溶出量的變化

在浸泡1 h 時(shí)，衰老青菜的Cl-和K+溶出量顯著多于Na+、Ca2+溶出量，前兩者對(duì)衰老青菜電導(dǎo)率變化貢獻(xiàn)較大。對(duì)于新鮮青菜，K+的溶出量對(duì)電導(dǎo)率所做貢獻(xiàn)最大，而對(duì)于新鮮青菜初始5 min 電導(dǎo)率是Na+溶出貢獻(xiàn)最大。見圖3、圖4。

貯藏0 d 青菜K+在開始20 s 沒有快速溶出，說明細(xì)胞外葉K+含量少，其溶出主要與膜滲透有關(guān)。放置0，3，7 d 青菜在前20 s 的K+溶出量幾乎一樣，說明青菜衰老過程，K+基本沒有滲漏到細(xì)胞外。然而，20 s 至440 s 時(shí)，貯藏3 d 青菜的K+溶出量顯著高于7 d，K+溶出和青菜衰老程度不相符，而與同期電導(dǎo)率反常一致，是電導(dǎo)率反常的一個(gè)內(nèi)在原因。此后，貯藏7 d 青菜的K+溶出量持續(xù)高于3 d。貯藏7 d 和3 d 青菜K+溶出量在30 min 左右達(dá)到高點(diǎn)，而0 d 青菜的K+在50 min 左右才達(dá)到高點(diǎn)，說明衰老青菜K+細(xì)胞膜滲出加快，總滲出量也增加。見圖3a、圖4a。

貯藏0 d 青菜Ca2+在開始20 s 快速溶出達(dá)到0.041 mg/g，貯藏3 d 青菜Ca2+溶出量低于0 d，而貯藏7 d 青菜Ca2+溶出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0 d，且貯藏7 d 青菜鈣離子在20～40 s 還持續(xù)快速溶出，隨后不同衰老青菜都呈緩慢線性上升或平移。貯藏7 d青菜Ca2+溶出量遠(yuǎn)高于對(duì)照，對(duì)照也遠(yuǎn)高于3 d 青菜溶出量。Ca2+主要存在于細(xì)胞外，一般認(rèn)為比細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)中鈣離子濃度高1 000 倍[15-16]。鈣與細(xì)胞壁中膠層的果膠質(zhì)結(jié)合形成果膠鈣[17]，果膠鈣通過粘結(jié)植物細(xì)胞壁物質(zhì)影響細(xì)胞壁的剛性，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分的變化是造成果實(shí)軟化的重要因素[18]。3 d Ca2+初期溶出慢，低于7 d 和0 d 青菜溶出量，可能與細(xì)胞壁中原果膠轉(zhuǎn)化為果膠酸有關(guān)，果膠酸比原果膠具有更強(qiáng)的結(jié)合鈣離子能力。在果蔬衰老過程中細(xì)胞壁的原果膠會(huì)轉(zhuǎn)化為果膠酸，進(jìn)一步降解成半乳糖。貯藏7 d 青菜Ca2+在初期快速溶出，其值遠(yuǎn)高于0 d，可能與此時(shí)果膠酸降解有關(guān)，大分子降解會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)合態(tài)的Ca2+在初期容易擴(kuò)散出來。不同衰老程度青菜Ca2+的溶出量下降和上升特別顯著，有望作為細(xì)胞壁變化的一個(gè)快速檢測(cè)指標(biāo)。見圖3b、圖4b。

圖3 添加不同衰老階段青菜的去離子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-變化（5 min）Fig.3 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 5 min

貯藏0 d 青菜Na+在開始20 s 溶出量達(dá)到0.125 mg/g，隨后基本沒有上升，說明開始20 s 內(nèi)快速溶出的Na+存在于細(xì)胞外，其本質(zhì)是細(xì)胞外擴(kuò)散。而此后青菜細(xì)胞內(nèi)的Na+溶出速度較慢，其本質(zhì)是通過膜滲透。貯藏7 d 青菜Na+在開始20 s 內(nèi)溶出量高于3 d，而3 d 青菜Na+在開始20 s 內(nèi)溶出量高于0 d，20～40 s 是轉(zhuǎn)換期，此后溶出速度變慢，說明青菜衰老過程細(xì)胞可能滲漏少量Na+，并積累在細(xì)胞間。從1 h 圖來看，貯藏7 d 青菜Na+溶出量在初期和后期都高于3 d 溶出量，而在240～1 520 s 時(shí)，貯藏3 d 青菜Na+溶出速度反而高于7 d 青菜，這可能也是造成貯藏3 d 青菜的電導(dǎo)率在前20 min 反常的原因。貯藏3 d 青菜Na+溶出速度始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0 d（1 h）。見圖3c、圖4c。

貯藏0 d 青菜Cl-在開始20 s 并沒有快速溶出，只比隨后溶出稍快一點(diǎn)。貯藏0，3，7 d 青菜Cl-在開始20 s 時(shí)溶出量基本一樣（圖3d）。根據(jù)圖3d的溶出試驗(yàn)，認(rèn)為青菜中Cl-主要存在于細(xì)胞內(nèi)，主要依靠滲透溶出。貯藏7 d 青菜Cl-溶出量高于3 d，且高于0 d。Cl-溶出量與衰老相符性好，Cl-溶出曲線呈3 條線性射線，新鮮青菜和中等衰老青菜的Cl-區(qū)分度高，而中等衰老和嚴(yán)重衰老青菜之間Cl-溶出區(qū)分度較差。見圖3d、圖4d。

3 結(jié)論

測(cè)定青菜電導(dǎo)率能較好反映其與衰老的相關(guān)性，然而浸泡前期電導(dǎo)率與衰老相符性差，測(cè)定青菜相對(duì)電導(dǎo)率需要流動(dòng)水浸泡30～60 min。Cl-和K+是4 種離子中溶出量較多的離子，Na+、Ca2+溶出量相對(duì)較少。Na+和K+前期溶出與衰老相符性較差，可能是造成電導(dǎo)率前期與衰老相符性較差的原因。

圖4 添加不同衰老階段青菜的去離子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-變化（1 h）Fig.4 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 1 h

青菜細(xì)胞外Na+和Ca2+濃度顯著高于細(xì)胞內(nèi)，初期溶出以擴(kuò)散為主，此后兩種離子溶出速度較慢，該溶出是以滲透為主，青菜衰老過程細(xì)胞可能滲漏了少量Na+，并積累在細(xì)胞間。青菜Ca2+溶出的反?，F(xiàn)象與細(xì)胞壁中果膠物質(zhì)轉(zhuǎn)化和降解有關(guān)，未來可以通過建立兩者相關(guān)性，測(cè)定Ca2+溶出變化來快速了解衰老和逆境下細(xì)胞壁完好性，特別是其主要成分果膠的變化。絕大多數(shù)Cl-和K+主要存在于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外含量很少，其主要依靠滲透溶出，衰老過程青菜基本沒有向細(xì)胞外滲漏并積累Cl-和K+。該兩種離子主要從細(xì)胞內(nèi)溶出，測(cè)定Cl-和K+濃度能判斷衰老和逆境下細(xì)胞膜完好程度。