孟德梅 張亞璇 楊 瑞 樊振川 申 琳 生吉萍

（1 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津300457 2 大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心 天津300457 3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 4 中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院 北京100872）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）作為一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用菌，受到國內(nèi)外越來越多消費(fèi)者的喜愛，是世界上栽培最多，產(chǎn)量最大，銷售最廣的食用菌[1]。然而，雙孢蘑菇仍以鮮銷為主，且其自身具有呼吸強(qiáng)度旺盛和含水量高的特點(diǎn)，導(dǎo)致子實(shí)體采后極易失水、開傘和發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響了雙孢蘑菇的食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。目前我國食用菌保鮮大多采用低溫、氣調(diào)、輻射、化學(xué)等幾種保鮮方法[3-4]，雖然有一定的保鮮效果，但存在成本高，能耗高，存在化學(xué)殘留，商業(yè)化程度低的問題。研究影響雙孢蘑菇采后貯藏品質(zhì)的內(nèi)在重要因素，并施以針對性地調(diào)控，對于雙孢蘑菇及同類型食用菌的貯藏保鮮具有科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。

精氨酸是生物體內(nèi)功能最豐富的氨基酸之一，在動植物體內(nèi)的生理功能已受到廣泛重視[5-6]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸除作為氮素貯藏營養(yǎng)外，它還在小麥[7]、平邑甜茶[8]、番茄[9-10]等植物的抗逆過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。此外，精氨酸代謝還與果蔬采后的貯藏品質(zhì)，如蜜橘果實(shí)的黃化[11]，青花菜營養(yǎng)物質(zhì)的流失和采后的衰老[12]有密切關(guān)系。精氨酸酶被認(rèn)為是雙孢蘑菇鳥氨酸循環(huán)中的重要酶之一[13]，其編碼基因（GenBank Accession NO.AJ640140）目前已被克隆。然而，與植物相比，精氨酸酶在食用菌中的生理功能，尤其在食用菌采后貯藏品質(zhì)中的作用還未見報(bào)道。本研究首次采用特異性精氨酸酶抑制劑Nω-羥基-nor-L-精氨酸（nor-NOHA）處理的方法，來抑制子實(shí)體內(nèi)精氨酸酶活性，進(jìn)而研究精氨酸酶在雙孢蘑菇采后貯藏品質(zhì)調(diào)控中的作用，以期為開發(fā)新型雙孢蘑菇保鮮方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（菌株編號A15）子實(shí)體，江蘇裕灌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司；選擇直徑為3～3.5 cm，大小均勻，無病蟲害，無損傷的子實(shí)體；將子實(shí)體分成兩組（試驗(yàn)組與對照組），每組120 個(gè)，每組再隨機(jī)分成3 份，用于3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

精氨酸酶抑制劑Nω-羥基-nor-L-精氨酸（nor-NOHA），純度≥97%，德國Merck 公司；α-異亞硝基苯丙酮、L-精氨酸，純度≥98%，美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、甲醇、Tris 等（均為國產(chǎn)分析純級），藍(lán)弋試劑公司。

1.2 處理方法

試驗(yàn)組雙孢蘑菇置于終濃度20 μmol/L 的精氨酸酶抑制劑溶液中浸泡處理2 min，浸泡結(jié)束后用紗布吸干水分，自然晾干后放于聚乙烯塑料筐中，用保鮮膜覆蓋，置于溫度為（4±1） ℃、濕度為85%～90%環(huán)境貯藏21 d。對照組子實(shí)體采用蒸餾水浸泡處理，其它條件同試驗(yàn)組。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 開傘率 開傘是指采后雙孢蘑菇在后熟階段菌柄、菌褶繼續(xù)生長，導(dǎo)致菌膜破裂的一種現(xiàn)象。開傘率的計(jì)算采用Jiang 等[14]的方法。

開傘率（%）=（Noc/Nt）×100

式中，Noc——開傘的蘑菇數(shù)；Nt——蘑菇總數(shù)。

1.3.2 酶活的測定 SOD、CAT 和PPO 酶液的提取均采用pH 7.0 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，酶活力分別采用貨號為A001-1，A007-1，A136 的南京建成試劑盒測定。SOD 活性以每毫克組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD 量為一個(gè)SOD 活力單位（U）；CAT 活性以每克（鮮重）雙孢蘑菇每秒鐘分解1 μmol 的H2O2的量為一個(gè)活力單位；PPO 活性以每分鐘每克組織在1 mL 反應(yīng)體系中在波長525 nm 處吸光度值變化0.01 為一個(gè)酶活力單位。

1.3.3 可溶性蛋白含量的測定 可溶性蛋白的提取緩沖液為pH 7.0 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，可溶性蛋白含量測定采用貨號為A045-2 的南京建成試劑盒進(jìn)行。

1.3.4 MDA 含量的測定 MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸法[15]。

1.3.5 總酚和類黃酮含量的測定 總酚和類黃酮含量的測定采用分光光度法[15-16]。

1.3.6 精氨酸酶活性的測定 參考Zhang 等[17]的方法對雙孢蘑菇果實(shí)精氨酸酶的活性進(jìn)行測定，并加以修改。取1 g 冷凍樣品，加入2 mL 預(yù)冷的提取緩沖液 【100 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5），含1%（體積分?jǐn)?shù)）β-巰基乙醇，0.l mmol/L PMSF】，冰浴研磨，于4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，上清即為酶提取液。酶溶液先用1 mmol/L MnCl2在37℃下激活10 min。0.5 mL 反應(yīng)體系，含40 μL 酶液，100 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液 （pH 9.5），250 mmol/L 精氨酸，2 mmol/L MnC12，33 μmol/L 尿素酶抑制劑對苯二酚，37 ℃下水浴反應(yīng)20 min，加入500 μL 的15%（體積分?jǐn)?shù)）高氯酸（PCA）終止反應(yīng)。取200 μL 反應(yīng)液，加入3 mL 酸混合液（體積分?jǐn)?shù)9%的磷酸和體積分?jǐn)?shù)27%的硫酸），充分混合，然后加入100 μL 用95%乙醇溶解3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的α-異亞硝基苯丙酮?；旌弦涸诜兴≈斜芄夥磻?yīng)60 min，快速冷卻后檢測波長540 nm 處的吸光值。以不同濃度的尿素溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶活性以每分鐘每克鮮重生成尿素的量表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010 軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖。應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用鄧肯多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間精氨酸酶活性的影響

為明確精氨酸酶在采后雙孢蘑菇貯藏保鮮過程中的重要作用，首先研究貯藏期間雙孢蘑菇子實(shí)體中精氨酸酶活性的變化規(guī)律。由圖1所示，對照組中精氨酸酶活性呈先逐漸增加后減小的變化趨勢，在14 d 達(dá)到最大值，為36.4 μmol/mg·min。雖然精氨酸酶抑制劑處理組子實(shí)體中精氨酸酶活性與對照組呈相似的變化規(guī)律，但是在整個(gè)貯藏過程中其精氨酸酶活性均顯著低于對照組 （P＜0.05），尤其貯藏至14 d 時(shí)，精氨酸酶活性僅為對照組的47.6%。結(jié)果說明，采用精氨酸酶抑制劑nor-NOHA 處理可有效抑制子實(shí)體中精氨酸酶的活性。

2.2 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間開傘率的影響

開傘是雙孢蘑菇從成熟走向衰老的重要感官指標(biāo)。在貯藏過程中（圖2），無論是精氨酸酶抑制劑處理組還是對照組的雙孢蘑菇，其子實(shí)體均從第3 天開始破膜開傘，且隨著貯藏時(shí)間的增加，開傘率均呈快速增長趨勢。貯藏第3 天，試驗(yàn)組和對照組的開傘率均僅為6%左右，無顯著性差異（P＞0.05）。然而，隨貯藏時(shí)間的延長，精氨酸酶抑制劑處理組的子實(shí)體開傘率始終顯著高于對照組（P＜0.05），為對照組的1.23～1.56 倍，說明抑制雙孢蘑菇中精氨酸酶的活性后明顯加速了子實(shí)體采后貯藏中的開傘進(jìn)程。

圖1 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間精氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of nor-NOHA treatment on the arginase activity of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

圖2 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間開傘率的影響Fig.2 Effect of nor-NOHA treatment on the cap opening percentage of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.3 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間抗氧化酶活性的影響

CAT 和SOD 兩種抗氧化酶，在生物體內(nèi)的活性氧（如過氧化氫和超氧陰離子）清除方面發(fā)揮著重要作用[18]。由圖3a 所示，在前14 d 的貯藏中，精氨酸酶抑制劑處理組和對照組中的CAT 活性變化趨勢基本一致，均呈先增加后下降繼而趨于平緩的趨勢；雖然兩組CAT 活性均在第1 天達(dá)到峰值水平，但精氨酸酶抑制劑處理顯著降低了CAT的峰值水平（P＜0.05），由對照組的5.9 U/g FW 降至3.16 U/g FW；尤其貯藏14 d 后，精氨酸酶抑制劑處理組的CAT 活性呈急劇下降的趨勢，而對照組的CAT 活性呈上升狀態(tài)。同樣從圖3b 可以看出，除了第1 天兩組樣品中SOD 水平無顯著性差異外，精氨酸酶抑制劑處理顯著抑制了整個(gè)貯藏過程中SOD 水平的上升（P＜0.05），尤其在貯藏7 d 后精氨酸酶抑制劑處理組中SOD 水平降低的尤為顯著，貯藏至第14 天時(shí)，對照組SOD 活性已達(dá)精氨酸酶抑制劑處理組的1.49 倍。以上試驗(yàn)結(jié)果說明，抑制雙孢蘑菇中精氨酸酶的活性不利于采后貯藏過程中子實(shí)體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活力的維持或改善。

2.4 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間褐變相關(guān)酶活性的影響

褐變是導(dǎo)致雙孢蘑菇感官品質(zhì)降低的重要影響因素之一，而多酚氧化酶（PPO）是引起雙孢蘑菇酶促褐變反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接決定雙孢蘑菇的白度。圖4結(jié)果顯示，精氨酸酶抑制劑處理組和對照組中PPO 活性在采后貯藏期間均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。對照組中的PPO 活性在前14 d 貯藏過程中逐漸降低，直至21 d 時(shí)上升至最高水平（22.08 U/g FW）；而精氨酸酶抑制劑處理組PPO 活性僅在貯藏1 d 內(nèi)有所下降，隨后即逐漸上升，7～14 d 時(shí)快速上升，至14 d時(shí)就到達(dá)峰值水平（22.6 U/g FW），說明精氨酸酶抑制劑處理加速了雙孢蘑菇采后貯藏中PPO 活性高峰的到來。而且，在貯藏后期精氨酸酶抑制劑處理組中PPO 整體水平顯著高于對照組 （P＜0.05），在貯藏14 d 時(shí)達(dá)到了對照組的4.7 倍。以上結(jié)果表明，抑制雙孢蘑菇體內(nèi)精氨酸酶活性后加快了子實(shí)體采后貯藏中的褐變速率。

2.5 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間膜脂過氧化產(chǎn)物含量的影響

MDA 含量的高低是反應(yīng)果蔬采后貯藏過程中膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。由圖5顯示，兩組子實(shí)體中的MDA 含量在整個(gè)貯藏過程中均呈逐漸增加的趨勢，說明雙孢蘑菇在采后貯藏過程中膜脂過氧化程度逐漸升高。MDA 含量在貯藏前期僅為1.67 μmol/g FW，貯藏21 d 后增加至3.8 μmol/g FW 左右，為貯藏前的2.28 倍。而且，精氨酸酶抑制劑組MDA 含量整個(gè)貯藏期始終顯著高于對照組（P<0.05），為對照組的1.2 倍左右。說明抑制精氨酸酶活性后加快了子實(shí)體采后膜脂過氧化程度的進(jìn)程。

圖3 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間CAT（a）和SOD（b）活性的影響Fig.3 Effect of nor-NOHA treatment on the activities of CAT （a） and SOD （b） of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

圖4 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間PPO 活性的影響Fig.4 Effect of nor-NOHA treatment on the PPO activity of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

圖5 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間MDA 含量的影響Fig.5 Effect of nor-NOHA treatment on the MDA content of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.6 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體貯藏期間抗氧化相關(guān)物質(zhì)含量的影響

雙孢蘑菇中富含多酚、類黃酮等重要抗氧化物質(zhì)，具有較高的抗氧化能力[19]。圖6為貯藏過程中子實(shí)體內(nèi)總酚和類黃酮含量的變化趨勢圖。從圖6a 可以看出，兩組子實(shí)體中總酚含量在貯藏期間變化幅度不大，呈先上升后下降最后緩慢上升的變化趨勢，且除貯藏第3 天時(shí)，精氨酸酶抑制劑處理組子實(shí)體中總酚含量顯著低于對照組（P<0.05）外，兩組子實(shí)體中多酚含量并沒有顯著性差異。由圖6b 可知，在整個(gè)貯藏過程中，兩組子實(shí)體中類黃酮含量呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，在貯藏前兩組子實(shí)體中類黃酮含量僅為0.15 OD325/g FW，貯藏21 d 后，精氨酸酶抑制劑處理組和對照組子實(shí)體中類黃酮含量分別達(dá)到0.45，0.6 OD325/g FW。而且，在整個(gè)21 d 的貯藏期間，精氨酸酶抑制劑處理組子實(shí)體中類黃酮含量均顯著低于對照組（P<0.05）。以上結(jié)果說明抑制雙孢蘑菇中精氨酸酶的活性不利于子實(shí)體采后貯藏中總酚和類黃酮物質(zhì)的積累，進(jìn)而可能對子實(shí)體自身抗氧化水平產(chǎn)生一定影響。

圖6 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間總酚（a）和類黃酮（b）含量的影響Fig.6 Effect of nor-NOHA treatment on the contents of total phenol （a） and flavonoid （b） of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.7 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢菇子實(shí)體采后貯藏期間可溶性蛋白含量的影響

圖7 精氨酸酶抑制劑處理對雙孢蘑菇子實(shí)體采后貯藏期間可溶性蛋白含量的影響Fig.7 Effect of nor-NOHA treatment on the soluble protein content of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

剛采摘的雙孢蘑菇在貯藏過程中，體內(nèi)的蛋白質(zhì)被分解為氨基酸，用于供給能量，促進(jìn)子實(shí)體的繼續(xù)膨脹，菌柄、菌褶的生長[20]。從圖7可見，兩組雙孢蘑菇子實(shí)體中可溶性蛋白的含量在貯藏1 d 內(nèi)均急劇減少，僅為處理前的50%左右，未呈現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。隨后，兩組處理中的可溶性蛋白含量變化幅度不大，整體呈緩慢下降的趨勢，而精氨酸酶抑制劑處理組子實(shí)體內(nèi)可溶性蛋白的含量在貯藏3 d 和14 d 時(shí)顯著高于對照組 （P<0.05），說明精氨酸酶抑制劑在抑制精氨酸酶活性的同時(shí)，可能也抑制了其它蛋白酶的活性，從而降低了子實(shí)體采后貯藏中蛋白質(zhì)的分解速度。

3 討論與結(jié)論

精氨酸酶是精氨酸代謝中的關(guān)鍵酶之一，其活性高低直接影響精氨酸代謝產(chǎn)物包括多胺、脯氨酸、尿素、鳥氨酸等物質(zhì)在生物細(xì)胞中的水平，在多種基本的代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[21-22]。精氨酸酶抑制劑nor-NOHA 是動物研究領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)[23-24]，可以與酶活性中心的Mn2+簇作用，特異性抑制精氨酸酶的活性，目前在動植物精氨酸酶的功能研究中得到了廣泛的應(yīng)用[24-25]。然而，目前精氨酸酶與食用菌采后生理功能和貯藏品質(zhì)關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本研究以食用菌研究領(lǐng)域的典型模式材料-雙孢蘑菇作為試驗(yàn)材料，借鑒動植物中的研究方法，首次利用nor-NOHA 抑制雙孢蘑菇中的精氨酸酶活性，來研究精氨酸酶在調(diào)控子實(shí)體采后貯藏品質(zhì)中的作用。

研究結(jié)果表明，采用20 μmol/L nor-NOHA處理可以很好的抑制雙孢蘑菇子實(shí)體內(nèi)精氨酸酶的活性，這與Zhang 等[26]在番茄果實(shí)中的研究結(jié)果一致，說明精氨酸酶的活性中心在生物體中具有良好的保守性。此外，結(jié)果顯示抑制雙孢蘑菇中的精氨酸酶活性后，子實(shí)體在采后貯藏過程中的CAT 和SOD 活性顯著降低，總酚和類黃酮含量積累降低、膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 含量持續(xù)增加并顯著高于對照組（P<0.05），這意味著精氨酸酶活性與采后雙孢蘑菇清除活性氧的能力和衰老程度有密切關(guān)系。Zhang 等[26]結(jié)果同樣證明了nor-NOHA處理后顯著抑制了番茄果實(shí)體內(nèi)的抗氧化酶活性，促進(jìn)了MDA 積累。Khalil 等[7]也發(fā)現(xiàn)精氨酸酶活性的升高與小麥苗在高溫脅迫下體內(nèi)SOD 和CAT 活性的提高，MDA 積累的下降有關(guān)。這些均與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

褐變是導(dǎo)致雙孢蘑菇感官品質(zhì)降低的一個(gè)非常重要的因素[2]，而PPO 酶活力與雙孢蘑菇的褐變程度顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9857）[27]，被認(rèn)為是引起雙孢蘑菇子實(shí)體褐變的重要酶。結(jié)果顯示nor-NOHA 處理顯著刺激了子實(shí)體貯藏期內(nèi)PPO 活性的增加（P<0.05），說明精氨酸酶活的降低加速了子實(shí)體采后的褐變進(jìn)程。除褐變外，開傘是表征雙孢蘑菇形態(tài)質(zhì)量的另一個(gè)重要參數(shù)[28]，也是區(qū)別于植物性果蔬的一個(gè)重要品質(zhì)指標(biāo)。采后貯藏過程中，雙孢蘑菇會繼續(xù)發(fā)育直至衰老，表現(xiàn)為菌膜破裂，菌褶逐漸擴(kuò)張，菌柄逐漸伸長，最終成熟菌褶暴露，釋放出孢子。這種由采后繼續(xù)發(fā)育導(dǎo)致的開傘過程，最終導(dǎo)致子實(shí)體中的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類發(fā)生遷移或缺乏，引起感官品質(zhì)的下降[28]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，nor-NOHA 處理后子實(shí)體的開傘率在整個(gè)貯藏期間均顯著高于對照組（P<0.05），表明精氨酸酶活的降低同樣加速了子實(shí)體采后的開傘進(jìn)程。與以上結(jié)果不同，精氨酸酶抑制劑處理后，雙孢蘑菇中可溶性蛋白含量在貯藏中的下降速率減慢。推測可能是因?yàn)閚or-NOHA 除抑制精氨酸酶活性之外，同時(shí)還抑制了其它蛋白酶的活性，從而表現(xiàn)為采后貯藏中可溶性蛋白分解成氨基酸的速率下降。田長恩等[23]試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制精氨酸酶活后，甜瓜子葉內(nèi)可溶性蛋白含量呈現(xiàn)與本試驗(yàn)有類似的變化趨勢，而精氨酸酶抑制劑處理對之無顯著影響。

綜上結(jié)果表明，20 μmol/L nor-NOHA 處理顯著降低了整個(gè)貯藏過程中雙孢蘑菇中的精氨酸酶活性，同時(shí)顯著抑制了子實(shí)體中抗氧化能力相關(guān)的酶活（SOD 和CAT）及抗氧化物質(zhì)（多酚和類黃酮）的積累，加速了子實(shí)體貯藏中的開傘和褐變進(jìn)程，加重了子實(shí)體的膜脂過氧化程度，從而加速了雙孢蘑菇采后貯藏中品質(zhì)的下降速率。